Урок-лекция "Бактериофагия, лизогения и лизогенная конверсия бактерий"
план-конспект урока по биологии (10 класс) по теме

Урок  -  лекция

«Бактериофагия, лизогения

и лизогенная конверсия бактерий»

(для учащихся 10 класса химико-биологического профиля)

Цели урока:

1. освоение знаний о роли биологической науки в формировании современной естественнонаучной картине мира (появление неклеточных форм жизни)
2. продолжить развитие познавательных интересов, интеллектуальных и творческих способностей в процессе изучения выдающихся достижений биологии
3. воспитание необходимости бережного отношения к собственному здоровью
4. использование приобретенных знаний и умений в повседневной жизни для обоснования и соблюдения мер профилактики заболеваний.

Задача: Рассмотреть особенности строения, жизнедеятельности бактериофагов и их значение в природе для человека.

Оборудование: таблицы по общей биологии, мультимедиа.

План лекции:

1. История открытия бактериофагии.

2.Морфология и особенности репродукции фага и его хозяина. Лизогения и лизогенная конверсия.

3.Обнаружение, выделение и очистка фага.

4.Использование бактериофагов в диагностике инфекционных болезней и других целей.

Литература

1.   С.Лурия, Дж. Дарнелл. Общая вирусология. М., 1970

2.  А.Г.Букринская. Вирусология. М., 1986

3.  А.И.Коротяев, С.А.Бабичев. Мед. микробиол., иммунол.

     и вирусология. СПб., 1998. 2000, 2001

Интернет ресурсы

www.bio.nature.ru- Научные новости биологии.

www.km.ru/education - Учебные материалы и словари на сайте «Кирилл и Мефодий»

Вирусы  бактерий   (бактериофаги)

        Бактериофаги (ныне просто фаги) — вирусы бактерий. Бактериофагия — процесс взаимодействия фагов с бактериями, заканчивающийся очень часто их разрушением (от лат. bacteriophaga — пожирающий бактерии).

Явление бактериофагии наблюдали многие ученые, но приоритет открытия фагов (1916 г.) принадлежит Ф. Д'Эреллю — канадскому ученому, работавшему в Париже в Институте Пастера.

Занимаясь изучением дизентерии, Феликс Д'Эрелль задумался над вопросом: почему возбудитель этой болезни, высевающийся в ее начале в большом количестве, в конце заболевания очень часто перестает выделяться? Заподозрив здесь действие какого-то агента, Д'Эрелль решил его обнаружить. С этой целью к свежей бульонной культуре дизентерийной палочки он стал добавлять по нескольку капель фильтрата испражнений больного. После одного из таких посевов Д'Эрелль и обнаружил этот агент по его способности разрушать дизентерийные бактерии. При добавлении к мутной бульонной культуре он вызвал ее просветление, а при добавлении к культуре, засеянной на плотную среду, появлялись прозрачные (стерильные) пятна - колонии. Способность вызывать такие пятна и размножаться при повторных посевах дали основание считать его живым корпускулярным агентом. Д'Эрелль назвал его Bacteriophagum intestinale, т. е. выделенный из кишечника пожиратель бактерий.

        Последующие наблюдения показали, что бактериофаги распространены повсеместно. Они встречаются всюду, где есть бактерии - в почве, воде, кишечном тракте человека и животных, гнойных выделениях и т. п. Особенно много фагов в сточных водах; из этого источника можно выделить практически любой фаг. Поскольку естественной средой обитания любого фага является микробная клетка, жизнь фагов связана с бактериями. Фагам присущи все биологические особенности, которые свойственны вирусам. Их геном представлен либо ДНК, либо РНК и заключен в белковую оболочку (капсид), структурные субъединицы которой уложены по типу либо спиральной, либо кубической симметрии. Крупные фаги, имеющие хвостик, устроены по типу бинарной симметрии (головка - икосаэдр, хвостик - спиральная симметрия). Фаги различаются по форме - нитевидные, сферические; фаги, имеющие головку и хвостик; по размерам - мелкие, среднего размера и крупные. Чем крупнее фаги, тем больше у них генов и сложнее их жизненный цикл. К самым маленьким относится нитевидный фаг М13 геном которого (однонитевая кольцевидная молекула ДНК с м.м. 2МД) содержит 8 генов.

        Наиболее сложно устроены крупные фаги, состоящие из головки и хвостика. У энтеробактерий обнаружено более 500 фагов, из них более 140 состоят из головки и хвостика. Например Фаг Т2, который  паразитирует у Е. coli и имеет следующую структуру: головка - икосаэдр, геном представлен двунитевой линейной ДНК, несущей около 200 генов. Головка с помощью воротника и зонтика связана с хвостиком, который имеет сложное строение — полый внутри стержень, заканчивающийся шестиугольной пластинкой с шестью шипами. Хвостик имеет белковый чехол, который состоит из 144 субъединиц, образующих 24 спирали; каждая белковая молекула содержит одну молекулу АТФ-азы и ион Са2+. Белок актиноподобный и способен сокращаться. В пластинке и шипах содержится лизоцим. Кроме того, хвостик имеет 6 ворсинок. У неактивного фага они свернуты и сложноэфирными связями прикреплены к белкам чехла. В момент адсорбции ворсинки раскрываются и обеспечивают плотное прикрепление фага к бактериальной клетке. Основное назначение хвостика - обеспечение адсорбции фага на клетке. Длина хвостика сильно варьирует. В тех случаях, когда хвостик содержит белковый чехол, последний, благодаря своему сокращению, обеспечивает проникновение стержня через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану.

        Резистентность фагов. По степени устойчивости к действию различных факторов внешней среды и химических веществ фаги занимают место между вирусами и неспоровыми бактериями. Они устойчивы в пределах рН от 5,0 до 8,0, большинство из них не инактивируется холодными водными растворами глицерина и этилового спирта. На них не действуют такие ферментные яды, как цианид, фторид, динитрофенол, а также хлороформ и фенол. Фаги хорошо сохраняются в запаянных ампулах и в лиофилизированном состоянии, но они легко разрушаются при кипячении, действии кислот, химических дезинфектантов, при УФ-облучении.

Жизненный цикл фага

        Различают фаги инфекционные, т. е. способные вызвать разные формы фаговой инфекции, и неинфекционные (вегетативные), или незрелые фаги, находящиеся еще в стадии размножения. В свою очередь инфекционные фаги разделяют на покоящиеся (находящиеся вне клетки), вирулентные (способные вызвать продуктивную форму инфекции) и умеренные фаги (способные вызывать не только продуктивную, но и редуктивную фаговую инфекцию).

        Жизненный цикл фага может проявляться в форме продуктивной (фаг размножается в клетке и выходит из нее), редуктивной (геном фага проникает в клетку, однако размножения фага не происходит, его геном интегрируется в хромосому клетки-хозяина, становится ее составной частью, т. е. фаг превращается в профаг, а клетка становится лизогенной) и абортивной инфекции, при которой взаимодействие фага с клеткой обрывается на какой-то стадии жизненного цикла фага, и он погибает.

        Клетка, несущая профаг, называется лизогенной, потому что профаг, передающийся клеткой по наследству, может выйти из хромосомы, активироваться и вызвать продуктивную форму инфекции.

        Если в результате лизогении, т. е. внедрения профага в хромосому клетки-хозяина, она получает новые наследуемые признаки, такую форму ее изменчивости называют лизогенной конверсией, т. е. изменчивостью, обусловленной лизогенией. Лизогенную конверсию вызывают только умеренные фаги.

        Жизненный цикл фага, сопровождающийся продуктивной инфекцией, складывается из 6 последовательных стадий, каждая из которых, в свою очередь, состоит из нескольких этапов.

        Адсорбция фагов на клеточной поверхности бактерий при помощи специфических рецепторов (белков-лоцманов), которые располагаются на кончике нити, шипа или хвостика. В свою очередь, на клеточной стенке бактерии располагаются ее фагоспецифические рецепторы, распознаваемые фагом. Адсорбция фага - пусковой момент его жизненного цикла. Она очень специфична и поэтому обусловливает возможность практического использования фагов, например для идентификации бактерий, а также для лечебных и  профилактических целей.

        Проникновение  фагового генома через клеточную стенку и  цито-плазматическую мембрану внутрь клетки и освобождение его от оболочки (раздевание фага).

        Установление  фагового  генома  с  помощью  белка-лоцмана для  реализации  содержащейся в геноме информации:

        а)        однонитевая ДНК -  к репликативному аппарату для синтеза комплементарной  ей  нити и образования репликативной формы; далее ее поведение аналогично двунитевой ДНК;

        б)        двунитевая ДНК - к транскрипционному аппарату для синтеза мРНК и последующей трансляции вирусспецифических белков (ферментов и структурных);

        в)        РНК-геном - к трансляционному аппарату для синтеза вирусспецифических белков (ферментов репликации и структурных).

        Репликация фаговой геномной ДНК или РНК. Сборка вновь синтезированных вирионов - заключение геномной НК в белковую оболочку, морфогенез фагов.

        Выход вновь синтезированных фагов из клетки:

        а) путем отпочковывания (М13 - единственный фаг, не вызывающий при выходе из клетки ее гибели);

        б) путем лизиса клетки изнутри. Он осуществляется свободным лизоцимом и вызывает гибель клетки.

        Степень зависимости репликации ДНК фага от хромосомы клетки определяется набором генов у фагов. Крупные фаги, например Т4, осуществляют репликацию полностью автономно; средние - частично нуждаются в помощи бактериальных генов, а мелкие (М13) почти полностью зависят от хромосомных генов.

        Жизненный цикл фага Т4 протекает следующим образом. С помощью своего хвостика фаг распознает специфический для него рецептор на поверхности клеточной стенки бактерий (чаще всего липополисахаридной природы) и прикрепляется к нему. Эта фаза адсорбции обратима, но затем, когда ворсинки раскрываются и плотно прикрепляют фаг к клеточной стенке, она становится необратимой. Пластинка со своими шипами прикрепляется к стенке, содержащийся в них лизоцим вызывает в месте контакта лизис клеточной стенки. Одновременно ионы Са2+ активируют содержащуюся в белках чехла АТФ-азу, и чехол сокращается. Его длина уменьшается в 2 раза, количество витков, также уменьшается в 2 раза — вместо 24 их становится 10—12. В результате сокращения чехла внутренний стержень прокалывает клеточную стенку в участке, разрушенном лизоцимом, и цитоплазматическую мембрану. Прокалывание происходит в участках напротив зон адгезии цитоплазматической мембраны и нижнего слоя пептидогликана. Таких зон около 200-300, их размер 20-30 нм.

        Внедрение фаговой ДНК в клетку происходит с помощью следующих механизмов: а) около 10% ее активно впрыскивается во время сокращения чехла хвостика; б) остальная часть фаговой ДНК втягивается в цитоплазму бактерий благодаря процессам транскрипции и работе трансляционного аппарата.

        Внутриклеточное размножение фага Т2 происходит в такой последовательности: уже через 1 мин. синтезируются ранние мРНК, кодирующие белки, необходимые для репликации фаговой ДНК; через 5 мин. начинается репликация ДНК; затем - синтез мРНК, необходимых для образования структурных белков фага и его морфогенеза, а через 13 мин. в клетке появляются первые вирионы. Процесс синтеза ДНК, белков и морфогенез фагов продолжается далее - из одного фага в клетке синтезируется 200—300 новых вирионов.

        Особенности морфогенеза фагов. Морфогенез мелких фагов протекает по типу самосборки. У крупных фагов этот процесс носит более сложный характер. Например, морфогенез фага Т4 требует активности более чем 40 генов и протекает при участии трех самостоятельных линий. На одной из них происходит сборка хвостика (участвует около 20 генов), на другой - головки фага (не менее 16 генов) и на третьей - сборка ворсинок (5 генов). Соединение хвостика с головкой не требует участия генов, однако оно не может произойти до тех пор, пока и хвостик, и головка не будут смонтированы полностью. Точно так же ворсинки могут присоединяться к хвостику только после того, как он соединится с полностью готовой головкой. Благодаря строгому генетическому контролю со стороны фага обеспечивается последовательность и согласованность всех процессов его внутриклеточного размножения.

        Выход сформировавшихся фагов в большинстве случаев происходит благодаря лизису изнутри свободным лизоцимом. Он синтезируется на самом последнем этапе размножения фага. Иногда бывает лизис бактерий извне как следствие адсорбции многих фагов на одной клетке, но при этом размножения фагов не происходит. Обычно же после внедрения фагового генома в клетку у нее возникает состояние иммунитета к суперинфекции данным фагом, т. е. проникновение других фаговых геномов становится невозможным. Иммунитет обеспечивается особым цитоплазматическим ре-прессором.

        Редуктивная инфекция Ее вызывают только умеренные фаги. В этом случае их жизненный цикл складывается из следующих стадий:

а) адсорбция фага на поверхности клетки;

б) проникновение фаговой ДНК в бактериальную клетку;

в) сайт-специфическая интеграция фаговой ДНК в хромосому клетки-хозяина и превращение фага в профаг.

        Если первые две стадии протекают так же, как в случае продуктивной инфекции, то третья требует участия дополнительных фаговых и хозяйских генов.

        Механизм интеграции фаговой ДНК в хромосому бактериальной клетки лучше всего изучен на примере фага λ (лямбда). Фаг состоит из головки и хвостика. Его геном представлен двунитевой линейной ДНК, имеющей «липкие» концы (избыточные нуклеотидные последовательности на противоположных концах нитей, комплементарные друг другу), поэтому она может переходить в кольцевую структуру, необходимую для ее включения в хромосому клетки-хозяина. Фаг λ включается в хромосому Е. coli с помощью сайт-специфической рекомбинации. Она оказывается возможной потому, что ДНК фага имеет особый участок - attP (от англ, attachment phage - прикрепление фага). Такой же участок имеется и в хромосоме  Е. coli - attB. В результате рекомбинации между этими участками (attP и attB), протекающей по механизму кроссинговера, фаговая ДНК оказывается включенной в хромосому. Таким образом, геном фага, интегрируясь в хромосому, превращается в профаг, а клетка становится лизогенной. Выходу профага из хромосомы препятствует цитоплазматический репрессор, который наделяет клетку одновременно иммунитетом против повторного инфицирования данным фагом. Синтез репрессора контролируется фагом. Однако профаг спонтанно или под воздействием различных факторов (химические вещества, облучение УФ, рентгеновскими лучами, повышенная температура) может выходить из хромосомы клетки и вызывать продуктивную инфекцию, заканчивающуюся лизисом клетки и выходом из нее вновь синтезированных вирионов.         Умеренные фаги играют важную роль в обмене генетическим материалом между бактериями. Этот процесс получил название трансдукции. Различают общую (генерализованную, или неспецифическую) .и специфическую трансдукцию.

        Общая трансдукция Механизм ее заключается в том, что в процессе внутриклеточного размножения фага в его головку может быть случайно включен вместо фаговой ДНК фрагмент бактериальной ДНК, равный по длине фаговой. Это вполне возможно, так как в инфицированной клетке биосинтез ее ДНК блокирован, а сама ДНК подвергается распаду. Таким образом в процессе репродукции фага возникают дефектные вирионы, у которых в головках вместо собственной геномной ДНК содержится фрагмент ДНК бактерии. Такие фаги сохраняют инфекционные свойства. Они адсорбируются на бактериальной клетке, вводят в нее ДНК, содержащуюся в головке, но при этом размножения фага не происходит. Введенная в клетку реципиента донорная ДНК (фрагмент хромосомы донора), если она содержит гены, отсутствующие у реципиента, наделяет его новым признаком. Этот признак будет зависеть от того, какой ген (гены) попал в головку трансдуцирующего фага. В случае рекомбинации привнесенного фагом фрагмента ДНК донора с хромосомой клетки-реципиента этот признак наследственно закрепляется.

        Специфическая трансдукция отличается от неспецифической тем, что в этом случае трансдуцирующие фаги всегда переносят только определенные гены, а именно, те из них, которые располагаются в хромосоме лизогенной клетки слева от attL или справа от attR. Специфическая трансдукция всегда связана с интеграцией умеренного фага в хромосому клетки-хозяина. При выходе (исключении) из хромосомы профаг может захватить ген с левого или правого фланга, но в этом случае он должен лишиться такого же размера своей ДНК с противоположного конца, чтобы ее общая длина оставалась неизменной (иначе она не может быть упакована в головку фага). Поэтому при такой форме исключения образуются дефектные фаги.

        Специфическую трансдукцию у Е. coli осуществляет не только фаг лямбда, но и родственные ему лямбдоидные и другие фаги. Трансдуцирующий фаг в случае инфицирования реципиентной клетки интегрируется в ее хромосому и привносит в нее новый| ген (новый признак), опосредуя не только лизогенизацию, но и лизогенную конверсию. Таким образом, если при неспецифической трансдукции фаг является только пассивным переносчиком генетического материала, то при специфической фаг включает этот материал в свой геном и передает его, лизогенизируя бактерии, реципиенту. Однако лизогенная конверсия может произойти и в том случае, если геном умеренного фага содержит такие собственные гены, которые у клетки отсутствуют, но отвечают за синтез существенно важных белков. Например, способностью вырабатывать экзотоксин обладают только те возбудители дифтерии, в хромосому которых интегрирован умеренный профаг, несущий оперон tox. Он отвечает за синтез дифтерийного токсина. Иначе говоря, умеренный фаг tox вызывает лизогенную конверсию нетоксигенной дифтерийной палочки в токсигенную.

        Фаги размножаются только за счет паразитирования в микробной клетке. Их размножение в бульонной культуре приводит к тому, что культура, бывшая перед добавлением фага мутной, через несколько часов инкубации при 37 °С становится прозрачной. На плотных средах фаги обнаруживают либо с помощью спот-теста, либо методом агаровых слоев, предложенным А. Грациа (1936 г.). В первом случае на поверхность агара в чашке засевают культуру, а затем на нее наносят каплю содержащего фаг материала. Если в нем содержится много вирионов, то на месте нанесения капли будет большое стерильное пятно.

        Метод агаровых слоев заключается в следующем. Вначале в чашку наливают слой питательного агара. После застывания на этот слой добавляют 2 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С 0,7% агара, в который предварительно добавляют каплю концентрированной суспензии бактерий и определенный объем суспензии фага. После того, как верхний слой застынет, чашку помещают в термостат. Бактерии размножаются внутри мягкого слоя агара, образуя сплошной непрозрачный фон, на котором хорошо видны колонии фага в виде стерильных пятен (рис. 84.2). Каждая колония образуется за счет размножения одного исходного фагового вириона. Применение этого метода позволяет: а) путем подсчета колоний точно определить количество жизнеспособных фаговых вирионов в данном материале; б) по характерным признакам (размер, прозрачность и др.), изучать наследственную изменчивость у фагов.

        По спектру своего действия на бактерии фаги подразделяются на поливалентные (лизируют родственные бактерии, например, поливалентный сальмонеллезный фаг лизирует почти все сальмонеллы), монофаги (лизируют бактерии только одного вида, например, фаг Vi-I лизирует только возбудителей брюшного тифа) и типоспецифические фаги, которые избирательно лизируют отдельные варианты бактерий внутри вида. С помощью таких фагов производится наиболее тонкая дифференциация бактерий внутри вида, с разделением их на фаговарианты. Например, с помощью набора фагов Vi-II возбудитель брюшного тифа делится более чем на 100 фаговариантов. Поскольку чувствительность бактерий к фагам является относительно стабильным признаком, связанным с наличием соответствующих рецепторов, фаготипирование имеет важное диагностическое и эпидемиологическое значение.

Практическое применение фагов

        Благодаря своему разрушающему (литическому) действию на бактерии фаги могут быть использованы с лечебно-профилактической целью при различных заболеваниях (дизентерия, холера, различные гнойно-воспалительные заболевания и т. д.). Наборы стандартных фагов, в том числе международные, используются для фаготипирования возбудителей ряда болезней (холеры, брюшного тифа, сальмонеллезов, дифтерии, стафилококковых и других заболеваний). Фаги широко используют для изучения генетики микроорганизмов.

Методы  диагностики  вирусных  заболеваний

        Для диагностики вирусных заболеваний применяют следующие методы:

Вирусоскопический.

Иммунной электронной микроскопии.

Вирусологический.

Серологический.

Иммунофлуоресцентный.

Биологический.

Использование ДНК- (РНК)-зондов.

Цепная полимеразная реакция.

        При вирусоскопическом методе в исследуемом материале обнаруживают с помощью электронной микроскопии вирионы или с помощью светооптической микроскопии — внутриклеточные включения. Метод электронной микроскопии дает возможность обнаружить вирионы, но он недостаточно специфичен. Гораздо более специфичным, чувствительным и надежным является метод иммунной электронной микроскопии. Он оказался особенно полезным для обнаружения тех вирусов, которые не размножаются в культуре клеток и для которых нет других тест-систем. В основе этого метода лежит взаимодействие антител с вирусами при смешивании вируссодержащего материала со специфической сывороткой. В результате взаимодействия антител с вирусами образуются микропреципитаты, состоящие из вирусных частиц, покрытых своеобразным «венчиком». Специфичность агрегации вирионов антителами позволяет надежно их идентифицировать. Разрешающая способность метода возрастает благодаря тому, что образование иммунных агрегатов повышает концентрацию вирионов в микропрепарате.