Исследовательская работа "Анализ условий питательной среды для бактерий"

Управление образования администрации города Черемхово

Муниципальное  общеобразовательное учреждение

«Лицей г.Черемхово»

Анализ условий  питательной среды для бактерий

Вид работы: исследовательская

Автор: обучающаяся  8 класса  

Федощева Екатерина

                                                        Руководитель:

Булгакова Светлана Владимировна,

учитель биологии

г. Черемхово

2016

Содержание

Введение.

Полезные и опасные, милые и ужасные, смертоносные и дающие жизнь. Они вокруг и их невозможно увидеть. Непросто отыскать более интересный объект для исследований. По количеству невероятных сюжетов мир бактерий можно сравнить с миром привидений. Но в отличие от изучения привидений, из информации о бактериях можно извлечь массу практической пользы, чем научное сообщество и занимается вот уже более ста лет.    

Учёные прогнозируют, что результаты изучения жизни бактерий в будущем приведут к:

• открытию секрета долголетия и даже бессмертия (во льдах найдены бактериальные сообщества, в которых обнаружены представители возрастом более миллиона лет);
• получению альтернативных источников энергии, в том числе и пищи;
• получение новых материалов биологического происхождения;
• формированию новых экосистем.

 Любое открытие в микробиологии сразу же подхватывается промышленниками, которые внедряют новые технологии в современное производство и предлагают результаты рынку.

Знакомясь с новинками, человек получает возможность не только оперировать более значительным объемом средств в достижении утилитарных целей, но и самостоятельно заглянуть в прошлое планеты Земля и в ее будущее.      

Проблема заключается в том, что микроорганизмы распространены повсеместно.  Все живые существа -  растения, животные и люди  - постоянно взаимодействуют с микробами, являясь часто не только их хранилищами, но и распространителями. Ни сверхнизкие температуры Антарктики, ни кипящие струи гейзеров, ни насыщенные растворы солей в соляных бассейнах, ни сильная инсоляция горных вершин, ни резкие колебания кислотности среды, ни многое другое не мешают существованию и развитию микрофлоры в природных субстратах. Взаимодействие человека с бактериальной микрофлорой неизбежно, а его характер зависит от биологической и экологической грамотности человека. Это делает актуальной тему исследования «Анализ условий  питательной среды для бактерий».

Цель исследования: изучение условий среды, способствующей росту и  размножению бактерий.

Задачи исследования:

1. Получить представление  о бактериях и условиях их культивирования;
2. Рассмотреть виды питательных сред для размножения бактерий;
3. Понять особенности размножения бактерий на жидких и плотных питательных  средах;
4. Раскрыть влияние факторов окружающей среды на микроорганизмы;
5. Провести бактериологическое исследование.

Объект исследования: бактерии.

Предмет исследования: рост бактерий на различных питательных средах.

Гипотеза: скорость  размножения микроорганизмов помимо видовой принадлежности зависит от состава  питательной среды, рН, температуры, аэрации и других факторов.

Методы исследования:  поисковый метод; наблюдение; анализ, синтез, сравнение; обобщение.

Научная значимость исследования заключается в расширении аппарата для решения  заданий ЕГЭ .  Практическая значимость исследования состоит в том, что его материалы могут быть использованы в образовательной деятельности по биологии, для проведения занятий в кружке, факультативных занятий.  

Обзор литературы

Бактерии и их размножение привлекло внимание учёных  со времён Левенгука, когда он впервые увидел их в микроскоп. В 1850-х годах Луи Пастер положил начало изучению физиологии и метаболизма бактерий, а также открыл их болезнетворные свойства.   Это послужило возникновению микробиологии – науки, которая

В разное время изучением бактерий занимались Гусев М. В.и Минеева Л. А., Заварзин Г. А., Герхардт Ф. и др. учёные микробиологи.

Рассмотрим наиболее значимые на современном этапе развития микробиологии научные труды, посвящённые питательным для бактерий средам.

К. Френкель в своей монографии «Основы учения о бактериях»^[1]   подробно охарактеризовал  питательные среды, принципы их классификации, требования, предъявляемые к питательным средам, условия культивирования микроорганизмов.

H. В. Прозоркина, П. А. Рубашкина. Свой труд «Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии» посвятили описанию методов микробиологических исследований^[2]. Эти труды и послужили методологической основой для нашего исследования.

1. Питательные среды для размножения бактерий: условия, виды

1. Бактерии и условия их культивирования

1.Размножение бактерий на жидких и плотных питательных  средах

Бактерии, как правило, характеризуются высокой скоростью размножения по сравнению с другими прокариотами. Скорость их размножения, помимо видовой принадлежности, зависит от состава питательной среды, рН, температуры, аэрации и других факторов. На плотных питательных средах бактерии образуют скопления клеток, называемые колониями. Внешний вид колоний у многих бактерий настолько характерен, что может служить одним из дифференциальных признаков для их идентификации. Колонии разных видов отличаются по своим размерам, форме, поверхности, окраске, прозрачности и др. Однако эти признаки могут изменяться в зависимости от условий культивирования.

      На жидких средах рост бактерий характеризуется образованием пленки на поверхности питательной среды, равномерного помутнения, либо осадка.

  Размножение бактерий определяется временем генерации, т. е. периодом, в течение которого осуществляется деление клетки. Продолжительность генерации зависит от вида бактерий, возраста, популяции, состава питательной среды, температуры и других факторов. В оптимальных условиях время генерации у разных бактерий колеблется довольно в широких пределах: от 20 минут у кишечной палочки до 14 ч у микобактерий туберкулеза, в связи с чем их колонии образуются через 18–20 ч либо через 3–5 недели соответственно^[3].

При выращивании бактерий в жидкой питательной среде наблюдается последовательная смена отдельных фаз в развитии популяции, отражающая общую закономерность роста и размножения бактериальных клеток.

Динамика развития бактериальной популяции представлена на рис.1

Рис.1. Динамика развития бактериальной популяции

I    - исходная стационарная фаза начинается после внесения бактерий в питательную среду. В течение данной фазы число бактериальных клеток не увеличивается.

II - лаг-фаза, или фаза задержки размножения, характеризуется началом интенсивного роста клеток, но скорость их деления остается невысокой. Две первые фазы можно назвать периодом адаптации бактериальной популяции, продолжительность которого определяется возрастом культуры, а также количеством и качеством питательной среды.

III  -лог-фаза,   или  логарифмическая   (экспоненциальная), фаза отличается максимальной скоростью размножения клеток и увеличением численности бактериальной популяции в геометрической прогрессии. Логарифмическая фаза у бактерий с коротким временем генерации продолжается несколько часов.

IV  - фаза отрицательного ускорения характеризуется меньшей активностью бактериальных клеток и удлинением периода генерации. Это происходит в результате истощения питательной среды, накопления в ней продуктов метаболизма и дефицита кислорода.

1.2.Принципы культивирования бактерий

     Микроорганизмы  культивируют, как правило, на искусственных питательных средах. В зависимости от пищевых потребностей того или другого вида питательные среды должны содержать соответствующие исходные вещества, необходимые для пластического и энергетического метаболизма.

Выделение микроорганизмов из различных материалов и получение их культур широко используется в лабораторной практике для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний, в научно-исследовательской работе и в микробиологическом производстве вакцин, антибиотиков и других биологически    активных    продуктов    микробной    жизнедеятельности.^[4]

     Условия культивирования также зависят от свойств соответствующих микроорганизмов. Большинство патогенных микробов выращивают на питательных средах при температуре 37 °С в течение 1–2 сут. Однако некоторые из них нуждаются в более длительных сроках. Например, бактерии коклюша – в 2–3 сут, а микобактерии туберкулеза – в 3–4 нед.

     Для стимуляции процессов роста и размножения аэробных микробов, а также сокращения сроков их выращивания используют метод глубинного культивирования, который заключается в непрерывном аэрировании и перемешивании питательной среды. Глубинный метод нашел широкое применение в биотехнологии.  

Требования к питательным средам. Для выращивания бактерий в лабораторных условиях, исследования их разнообразных свойств, длительного хранения используют питательные среды. Они должны отвечать определенным стандартам, создавая оптимальные условия для роста, размножения и жизнедеятельности микроорганизмов.

      В первую очередь, бактерии нуждаются в азоте, углероде и водороде для построения собственных белков. Водород и кислород для клеток поставляет вода. Источником азота выступают многочисленные вещества, в основном, животного происхождения (мясо говяжье, рыба, мясо-костная мука, казеин. Можно использовать и заменители мяса – плаценту, кровяные сгустки, дрожжи. Следовательно, в состав сред должны быть введены источники питательных веществ и вода, а также ростовые факторы (витамины группы В, ферменты). Универсальным источником их служат экстракты из белков животного и растительного происхождения. Для микробов с более сложными пищевыми потребностями в состав сред включают  субстраты – кровь, сыворотку, яичный желток, кусочки печенки, почек, мозговой ткани и др.^[5]

     Среды должны быть сбалансированными за микроэлементным составом и содержать ионы железа, меди, марганца, цинка, кальция, натрия, калию, иметь в своем составе неорганические фосфаты.

     Среды должны иметь определенную вязкость, плотность, иметь определенную влажность (до 20 % воды), быть прозрачными и обязательно стерильными.

      Oсновные требования к питательным средам: прозрачность; стерильность;   лёгкая усвояемость; определенный состав азотистых веществ, углеводов, витаминов; определённая вязкость.

                                   1. 3. Основные питательные среды.

      Многочисленные потребности микроорганизмов предопределяют большое разнообразие питательных сред, а для отдельных видов бактерий существуют специальные среды. Часть их готовят в лабораториях непосредственно перед посевом, но с каждым годом появляются все новые и новые среды заводского изготовления (сухие), которые способны удовлетворить самые прихотливые потребности микробиологов. Они сохраняются длительное время, имеют стандартный состав.

      Среды разделяются на естественные и искусственные. Для создания естественных сред используют свернутую сыворотку, молоко, яйца, мышечную ткань.    

      Искусственные среды создают путем комбинирования разнообразных субстратов, которые обеспечивают те или другие потребности микроорганизмов. Их используют в основном для экспериментального изучения отдельных звеньев метаболизма бактерий.

      В зависимости от своей плотности, среды разделяются на жидкие, полужидкие и плотные. Полужидкие и плотные среды готовятся из жидких, добавляя соответственно 0,3-0,7 % но 1,5-2,0 %  агара. Последний представляет собой волокнистый материал, который добывают из морских водорослей. Состоит он из полисахаридов (70-75 %), белков (2-3 %).   Для создания плотных сред используют также желатин (10-15 %), свернутую сыворотку крови.

     В зависимости от потребностей бактериологов питательные среды разделяются на пять основных групп (прил.1 таблица 1) .

Первая группа – универсальные (простые) среды. К ним принадлежат мясо-пептонний бульон (МПБ) и мясо-пептоннийагар (МПА). За своим составом, наличием питательных веществ они пригодны для культивирования многих видов бактерий.

Вторая группа – специальные среды. Они используются в тех случаях, когда микроорганизмы не растут на простых. К ним принадлежит кровяной, сывороточный агары, сывороточный бульйон, асцитический бульйон, асцит-агар и другие.

Третья группа – элективные  среды, на которых микроорганизмы определенного вида растут быстрее, более интенсивно, опережают в своем развитии другие виды бактерий.  

Четвертая группа  селективные среды, которые благодаря добавлению определенных компонентов (желчь, краски, антибиотики и др.) способны подавлять развитие одних видов микроорганизмов, но не влияют на другие виды.  

Пятая группа – дифференциально-диагностичнеские среды. Это большая группа сред, которые позволяют определить определенные биохимические свойства микроорганизмов и проводить их дифференциацию.

      Рис.2.Среда  Плоскирева.                         Рис.3.   Среда Левина

2.Влияние окружающей среды на микроорганизмы

Рассмотрим факторы окружающей  среды, влияющие на микроорганизмы.

          Температура. Низкие температуры бактерии выдерживают сравнительно легко. Культуры микроорганизмов в замороженном виде сохраняются в лабораторных условиях более чем 80 лет. Выделено жизнеспособный микроорганизм из толщи ледников,   возраст которых 12 000 лет.

Холерный вибрион не погибает при температуре  -32 °С; некоторые виды бактерий хранят жизнеспособность при температуре жидкого воздуха ( -190 °С),  жидкого водорода (-253 °С).  

Низкие температуры прекращают процессы гниения и брожения. На этом принципе основывается использование в практике ледников, погребов и холодильных установок для хранения пищевых продуктов.

       Пагубно действуют на бактерии высокие температуры. Большинство  бактерий погибают при температуре 58–60 °С через 30–60 мин, при 100 °С – в течение  2–3  мин. Силикатные бактерии сохраняются жизнеспособными после деяния на них нагревание до  160 °С.

       Высушивание. Стойкость микроорганизмов к высушиванию разная. Чувствительные к высушиванию гонококки, менингококки, трепонемы, лептоспиры, гемофильные бактерии, фаги. Холерный вибрион не погибает под воздействием высушивания 2 сутки, шигели– 7, чумная палочка – 8, дифтерийная –30, брюшнотифозная – 70, стафилококки и микобактерии туберкулеза – 90 суток. Высохшая мокрота больных туберкулезом остается заразной 10 месяцев, споры бацилл сибирской язвы сохраняются до 10 годов, плесневых грибов – 20 лет.

       Лучевая энергия. Разные виды излучения имеют бактерицидное или стерилизующее действие. К ней принадлежат ультрафиолетовое, рентгеновское, альфа-, бета-, гамма- и нейтронное излучение. Наиболее выраженное бактерицидное действие имеет прямой солнечный луч.

       Высокое давление, ультразвук, механическое сотрясение. Воздействие высокого атмосферного давления 10 132,5 – 91 192,5 кПа (100–900 атм) на глубине морей и океанов 1000–10 000 м бактерии переносят легко. Дрожжи хранят свою жизнеспособность при давлению 50 662,5 кПа (500 атм). Некоторые бактерии, дрожжи, плесневые грибы выдерживают давление 303 975 кПа (3000 атм),   фитопатогенные вирусы – 506 625 кПа (5000 атм).

Ультразвук имеет бактерицидные свойства, которые используют для стерилизации пищевых продуктов, изготовления вакцин и дезинфекции предметов.

3. Проведение бактериологического исследования

3.1 Организация проведения бактериологического исследования

Объекты исследования: сенная палочка и молочный стафилококк

Метод исследования: бактериологический

Методика исследования: Для  посева микроорганизмов в левую руку берут две пробирки. В одной находится питательная среда, в другой – исследуемый материал. Пробирки зажимают большим и указательным пальцами. Для того, чтобы можно было наблюдать за содержанием пробирок, их держат сверху кисти руки. Сначала стерилизуют петлю в верхней части пламени газовой горелки. Пробирки открывают и край их проносят через пламя горелки. Петлю опускают в пробирку, где есть исследуемый материал, и, осторожно касаясь стенки, охлаждают. В последующем петлю опускают в пробирку и набирают материал. Петлю вынимают из пробирки, пробки и края пробирок проносят через пламя и закрывают. Петлю прожаривают в пламени, чтобы уничтожить микроорганизмы. Через 24 часа производится  рассев взвеси микроорганизмов на выбранные питательные среды в Чашки Петри. Затем чашки  закрывают, переворачивают вверх дном, подписывают специальным карандашом и ставят в термостат при оптимальной температуре (37 °С) на 18-48 часов. Цель этапа – получить изолированные колонии микроорганизмов^[6].  

База исследования: бактериологическая лаборатория ФБУЗ

"Центр гигиены и эпидемиологии в Иркутской области, в Черемховском и Аларском районах"

Консультант: Бушина Тамара Афанасьевна-заведующая бактериологической лабораторией ФБУЗ

Ход исследования

1.Анализируемые образцы высеяли на различные питательные среды: агар Плоскирева, среда Кесслера и  среда Плоскерева  в чашках Петри.  (Рис.3)                                                                        

                                                       Рис.3

      2.Высевание  на твердой питательной среде провели  путем рассева взвеси микроорганизмов шпателем (метод Коха) и   с помощью бактериологической петли (метод истощающего штриха).  

Рассев шпателем (метод Коха) произвели  в следующей последовательности:

1) на поверхность питательной среды в чашке № 1 нанесли стерильной пипеткой каплю накопительной культуры и распределили  ее стерильным шпателем;

2) шпатель достали, чашку быстро закрыли и перенесли  шпатель в чашку № 2, не стерилизуя его.  Распределили культуры по всей поверхности среды, прикасаясь к ее поверхности той же стороной шпателя, которой ранее распределяли пробу;

 3) засеянные чашки поместили в термостат и проинкубировали при оптимальной температуре.

     3.Через 24 часа чашки достали из термостата и изучили рост микроорганизмов.  В чашке № 1 увидели  сплошной рост бактерий, в последующих чашках отмечают колонии. (рис.4)

                                                                 Рис.4

       4.Провели  посев бактерий на питательные среды с различным значением рН. Посев проводят в четыре пробирки на МПА с различным значением рН: в одной из них рН равно 3, во второй – 5, в третьей – 7 и в четвертой – 9. Перед началом посева каждую пробирку подписали: указали значение рН и поставили свой номер (рис.5)

Рис.5

3.2. Результаты бактериологического исследования

     1.Провели оценку роста бактерий на средах с различными значениями рН  по степени мутности среды. Перед этим  содержимое каждой пробирки тщательно перемешали  (вращая пробирки между ладонями) и затем сравнили друг с другом. Для оценки интенсивности развития бактерий пользуются условными обозначениями: рост отсутствует (-); рост слабый (+); рост умеренный (++); рост сильный (обильный) (+++). Степень мутности оценивается визуально. Полученные данные зафиксировали в таблице 1 и сделали вывод о влиянии рН на развитие взятых для посева бактерий.

Таблица 1

Интенсивность развития бактерий при различных значения рН

2. Провели оценку роста бактерий после воздействия на них высокой температуры. Для этого взяли две пробирки со стерильным изотоническим раствором (Рис.6)        

                 (Рис.6).

В одну внесли культуру сенной палочки, а во вторую – молочнокислого стрептококка. Обе пробирки поместили в кипящую водяную баню на 10 мин. После кипячения пробирки охладили и из каждой  сделали посев при помощи петли на косой агар.  Действие высоких температур на спорообразующие и неспорообразующие бактерии определяют по характеру роста микроорганизмов на косом агаре (сплошной, в виде отдельных колоний или обильный, слабый, умеренный, отсутствие роста). Полученные данные зафиксировали в таблице 2

Таблица 2

Действие температуры на спорообразующие и неспорообразующие бактерии

 Заключение

     Сформулированная цель и задачи  исследования достигнуты, гипотеза подтверждена. Сделаны выводы о том, что:

1. Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной среды, сильно зависит от физических и химических факторов (температуры, кислотности, аэрации, света и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболизма каждой группы бактерий.
2. Каждый вид микроорганизмов может размножаться при строго определенном  рН среды. Приспособленность к узким зонам реакции среды — это результат эволюции микроорганизмов. Существуют микроорганизмы, способные размножаться в кислых средах, например дрожжи, молочнокислые, уксуснокислые, пропионовокислые бактерии. Сенная палочка и большинство бактерий наиболее активно развиваются при нейтральной реакции среды, а гнилостные бактерии хорошо размножаются в щелочной среде.
3. Различное отношение микроорганизмов к реакции среды используют для создания условий для выращивания полезных, а также и для борьбы с вредными микроорганизмами. Например, чтобы не развивалась тягучая болезнь в хлебе, вызываемая сенной палочкой, повышают кислотность теста. Оптимальная величина рН для дрожжей 4—6, для молочнокислых бактерий — 4— 5, для сенной палочки — б—7, для гнилостных бактерий— 7—8., что и доказало наше исследование.
4. В процессе жизнедеятельности микроорганизмы изменяют реакцию среды в результате выделения клетками продуктов обмена веществ, влияющих на кислотность.

      Работа по теме  исследования «Анализ условий питательной среды для бактерий» способствовала развитию у  автора умений экспериментировать, делать выводы, рассуждать, анализировать и систематизировать .

    Материалы проведенного исследования выходят за рамки программы курса по биологии на уровне среднего общего образования,  будут полезны учащимся при подготовке к итоговой аттестации, а также могут быть использованы на уроках биологии при изучении темы «Бактерии».

Список использованных источников

1..   Актуальные вопросы эпидемиологии и инфекционных болезней. / Н.А. Семина. - М.: Медицина, 1999

2.Борисов Л.Б., Козьмин- Соколов Б.Н., Фрейдлин И.С.. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии, иммунологии. /Под ред. Борисова Л.И. – М.: Медицина, 1993.-С. 42-56, .79-90.. 3. Джавец Э., Мельник Дж. Л., Эйдельберг Э.А. Руководство  по медицинской микробиологии. 1 т. Пер. с англ. – М.: Медицина, 1982.

4.   Егоров Н.С. Практикум по микробиологии. М 1976

5. Прозоркина H. В. ,Рубашкина П. А. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии, 2002

6.  Френкель К., "Основы учения о бактериях"

7. http://www.bibliofond.ru/view.aspx?id=458689

 8. http://www.vevivi.ru/best/Pitatelnye-sredy-dlya-bakterii-ref168812.html

Приложение 1

Таблица 1

Классификация питательных сред