Аминокислотный состав маточного молочка

Городской  научно – практический  марафон «Шаги в науку».

I этап

Секция «Химия»

Аминокислотный состав

маточного молочка

исследовательская работа

Выполнена учеником 11 класса

 МБОУ «СОШ  №226»

Вериным Вячеславом Витальевичем

                                                Научный руководитель –

                                                             учитель химии высшей категории  

                                                МБОУ «СОШ №226»

                                    Лунина Людмила Дмитриевна

г. Заречный, 2013

Оглавление

Введение ………………………………………………………………………3

Теоретическая часть……    ………..………………………………………  4

Экспериментальная часть

Методика проведения эксперимента………………………………………..  7

Результаты и выводы……………………….……………………………… 13

Заключение………………………………………………………………… . .14

Литература…………………………………………………………………...  15

Приложение…………………………………………………………………   Введение

                Маточное молочко (или «королевское желе») — это один из самых загадочных продуктов пчеловодства, который содержит практически все вещества, необходимые для развития и жизнедеятельности живого организма, — белки, жиры, углеводы, витамины, ферменты, аминокислоты, макро- и микроэлементы. В пчелиной семье маточное молочко предназначено для вскармливания потомства. Питаясь им, личинка матки очень быстро растёт — за первые 6 дней жизни её вес увеличивается в 2500 раз (!). Сформировавшаяся пчелиная матка всю свою жизнь питается маточным молочком, поэтому и живёт в 50 раз дольше рабочих пчёл и производит за свою жизнь несколько миллионов яиц.

При правильном применении маточное молочко может оказать неоценимую помощь и нашему организму.

Цель работы:  исследование аминокислотного состава маточного молочка в препаратах «Апилак»

Задачи:

1. Обнаружение белков в препаратах «Апилак» (биуретовая реакция);
2. Определение содержания белка методом Лоури;
3. Количественное определение аминокислот;
4. Определение содержания низкомолекулярных пептидов;
5. Определение суммарного содержания свободных аминокислот;
6. Разделение аминокислот методом бумажной хроматографии

Объект исследования: препараты «Апилак» производства ЗАО «Вифитех» (Россия) и Grindex (Латвия).

Гипотеза исследования: аминокислотный состав препаратов «Апилак»

 одинаков у разных производителей

Проблема исследования: недостаточная изученность аминокислотного состава и свойств пчелиного маточного молочка.

Актуальность исследования: поскольку маточное молочко является многокомпонентной субстанцией, исследование его состава приближает нас к более детальному пониманию его роли в природе и жизни человека.

Практическая значимость работы заключается в том, что наработанный материал может быть использован для определения наиболее удачных сфер применения маточного молочка в качестве БАДа, а так же  на уроках химии, биологии и факультативных занятиях.

Теоретическая часть

Физико-химические свойства маточного молочка.

Маточное молочко представляет собой питательное вещество желтовато-белого цвета, сметанообразной консистенции, со специфическим запахом и кисловато-жгучим вкусом. Не обладающее жгучим вкусом и пенящееся молочко не пригодно к употреблению. Проверять качество этого продукта пчеловодства лучше в лабораторных условиях, где можно с наибольшей точностью определить натуральность «королевского желе», но можно сделать это и в домашних условиях, например, добавив в маточное молочко несколько капель щелочи. Натуральное молочко станет прозрачным. К. Кузьмина в своей книге «Продукты пчеловодства и здоровье» описывает еще один способ определения качества маточного молочка: «32 мг свежего маточного молочка поместить в химический стакан емкостью 25 мл, прибавить 10 мл охлажденной кипяченой воды и перемешивать стеклянной палочкой в течение 5–7 минут. Отсосать пипеткой 2 мл полученного водного раствора маточного молочка, вылить его в пробирку и добавить 1 мл 20%-ной серной кислоты. Содержимое пробирки перемешать и к смеси добавить одну каплю 0,1Н раствора перманганата калия. Если молочко натуральное, то через 2–4 сек. произойдет обесцвечивание перманганата калия».

Маточное молочко по сравнению с другими продуктами пчеловодства является менее стойким при хранении. Наиболее оптимальные условия хранения – места, защищенные от света, и температура, близкая к 0°С.

Маточное молочко, как и другие продукты пчеловодства, имеет сложный химический состав. В нем содержится около 65% воды, 14–18% белковых веществ, 9–19% углеводных соединений и 1,7–5,7% липидов. В последнее время в маточном молочке обнаружены и нуклеиновые кислоты: рибонуклеиновая кислота (РНК) и дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). РНК содержится в сравнительно большом количестве не только в свежем маточном молочке, но и сохраняется в нем при длительном хранении. ДНК обнаруживается лишь в нативном маточном молочке. Из маточного молочка выделены также и ферменты, принимающие участие в обмене нуклеиновых кислот. Аминокислотный состав маточного молочка аналогичен составу продуктов животного происхождения, но значительно превосходит по содержанию глютаминовой и аспарагиновой кислот, которые необходимы для нормальной работы головного мозга (7).

Маточное молочко – поливитаминный продукт. В нем обнаружено большое количество витаминов Е, РР, Н, группы В. Количественное содержание витаминов в маточном молочке, по данным различных авторов, приведено в таблице 2 (см. приложение). В данном продукте пчеловодства содержится около 15 микроэлементов, в числе которых: железо, магний, марганец, сера, цинк, кобальт, кальций, никель, серебро и др. Наибольшее значение среди этих веществ имеет кобальт, участвующий в обменных процессах, недостаток которого вызывает торможение синтеза белков.

        Для нормального роста и развития организма человека и животных необходимы так называемые незаменимые аминокислоты, т. е. те, которые организм не может синтезировать сам и должен получать в готовом виде. Установлено, что маточное молочко содержит все незаменимые аминокислоты: аргинин, гистидин, валин, метионин, триптофан и др., (см. приложение).

Белки маточного молочка относятся к числу хорошо усвояемых. Так, белки мяса усваиваются организмом человека только на 69—74%, а маточного молочка — на 81%.

Целебные свойства маточного молочка

                При правильных дозировках маточное молочко способно оказывать положительное воздействие на работу сердечнососудистой и нервной систем, регулировать обмен веществ, нормализовать работу желез внутренней секреции и улучшать состав крови. Кроме того, маточное молочко обладает иммуномодулирующим действием, оказывающим пагубное влияние на раковые клетки, мощным антиоксидантным действием, позволяющим эффективно применять «королевское желе» при профилактике и лечении лучевой болезни, в онкологии и при стрессовых состояниях, сопровождающихся активацией свободно-радикальных     процессов. Маточное молочко обладает общеукрепляющим действием, повышает аппетит и защитные силы человеческого организма и даже потенциально лечит некоторые виды мужского и женского бесплодия.

        Для применения в лечебных целях маточное молочко было рекомендовано в 1922 году Р. Шовэном, профессором Сорбоннского университета, а более широкое использование этого продукта пчеловодства началось в 1955 г. В Японии были проведены масштабные исследования по восстановлению организма после атомных бомбардировок Хиросимы и Нагасаки. В ходе их проведения было обнаружено, что самым эффективным способом восстановления организма является употребление «королевского желе». И теперь по всей Японии в детских садах и школах введено ежедневное 3х-разовое употребление пчелиного маточного молочка.

В настоящее время выпускаются различные препараты,  содержащие маточное молочко.

Противопоказания к применению маточного молочка

                Употребляя маточное молочко в чистом виде или в составе лекарственных препаратов, следует помнить, что оно является сильным биостимулятором, поэтому при употреблении могут возникать побочные эффекты. Лечение маточным молочком, как и другими продуктами пчеловодства, требует предварительной консультации специалиста.

У некоторых людей наблюдается повышенная чувствительность к маточному молочку. Появление первых признаков аллергической реакции – сигнал к прекращению приема препаратов, содержащих этот продукт пчеловодства.

При приеме маточного молочка необходимо строго придерживаться дозировок, иначе эффект может оказаться противоположным ожидаемому. Оптимальная среднесуточная доза маточного молочка – 20–30 мг, однако все зависит от индивидуальной переносимости пациентом продуктов пчеловодства.

При передозировке препаратов маточного молочка, помимо общего перевозбуждения организма, отмечается учащенное сердцебиение и нарушение сердечного ритма в первые 2–3 дня приема препарата.

Лечение маточным молочком противопоказано пациентам, страдающим инфекционными и некоторыми эндокринными заболеваниями.

Экспериментальная часть

Методика проведения эксперимента

1. Подготовка проб.  

Для исследования использовались аптечные препараты:

«Апилак» ЗАО «Вифитех», Россия (образец I) и «Апилак» Grindex, Латвия (образец II) в таблетированной форме с содержанием лиофилизированного маточного молочка 20 мг в одной таблетке. Масса каждой таблетки доведена производителем до 150 мг фармакологически-нейтральными компонентами (крахмал картофельный, магния стеарат и др.)

Препарат измельчали в фарфоровой ступке до образования однородного порошка. Затем 1,5 г измельченного препарата растворяли в 10 мл дистиллированной воды и для более полной экстракции растворимых веществ, 30 минут встряхивали на шуттель-аппарате при комнатной температуре. Полученную смесь подвергли центрифугированию при 5000 об/мин. в течение 30 минут. Таким образом, полученный раствор содержал 20 мг маточного молочка в 1 мл. Надосадочную жидкость отбирали и проводили дальнейшие исследования.

2. Открытие белков в  пробах (биуретовая реакция)

В пробирку наливают 1 мл образца (надосадочная жидкость) и добавляют 1 мл 2М раствора NaOH и несколько капель 10% раствора CuSO4.

Содержимое пробирки встряхивают. Появляется ярко-фиолетовое окрашивание, связанное с взаимодействием пептидных связей белковых молекул со свежеосажденным Cu(OH)2. Реакция имеет высокую чувствительность, поэтому даже при разбавлении белка 1:10000 наблюдается положительный результат.

3. Колориметрическое определение общего белка методом Лоури.

Принцип метода: определение белка основано на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина- Чокальтеу в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи. Метод характеризуется высокой чувствительностью (концентрация открытия белка 5 мкг/мл).

Реактивы:

Реактив «А» - 4% Na2CO3 в 0,1н NaOH;

Реактив «Б» - 2% K-Na тартрат в 1% CuSO4;

Реактив Фолина (фосфомолибденовофенольная смесь).

Стандартный раствор белка (100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА)).

Оборудование: Фотоэлектроколориметр (ФЭК).

Ход работы:

Для построение калибровочного графика готовят разведения 10-100 мкг/мл с шагом 10 мкг/мл.

Схема определения белка методом Лоури                        Таблица 1

Опыт проводят в 3 параллелях.

Полученные значения откладывают на миллиметровой бумаге в координатах D-C. Затем аппроксимируют точки, получая калибровочный график (приложение, рис. 1). Методом регрессионного анализа можно получить уравнение зависимость оптической плотности (D) от концентрации белка (С). В нашем случае оно имело вид: D(C) =0,0038691C        (1)

В качестве исследуемой субстанции использовалась разведенная в 10 раз надосадочная жидкость, полученная после центрифугирования. Определение проводилось согласно таблицы 1.

Оптическая плотность (D) контрольных проб:

Оптическая плотность (D) исследованных образцов:

Δ=Dcp - Kcp

Преобразуя уравнение(1) относительно С, можно вычислить концентрацию белка: С=D(C)/0,0038691 (см. результаты и выводы)

4. Содержание низкомолекулярных пептидов.

Для определения низкомолекулярных пептидов пригоден метод Лоури, однако предварительно необходимо избавиться от высокомолекулярных белков.

Для удаления высокомолекулярных белковых фракций использовался 10% раствор трихлоруксусной кислоты. К 1 мл надосадочной жидкости прибавлялось 0,5 мл 10% ТХУ. Денатурированные белки осаждали центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 минут. Далее отбиралась надосадочная жидкость, в которой определялось содержание низкомолекулярных пептидов методом Лоури.

Оптическая плотность (D) исследованных образцов:

 5. Определение суммарного содержания свободных аминокислот.

Принцип метода основан на способности нингидрина в присутствии аминокислот в щелочной среде образовывать стойкий окрашенный комплекс:

Для определения использована безбелковая надосадочная жидкость, полученная при исследовании на пептиды.

        К 0,5 мл исследуемого образца (предварительно разведенного в 100 раз) прибавляют 1 мл нингидринового реактива. Полученную смесь инкубируют на водяной бане при температуре 700С в течение 20 минут. Полученные образцы колориметрируют при λ=690нм против раствора сравнения, в котором вместо исследуемого образца была дистиллированная вода. Для расчета количественного содержания аминокислот использовался метод одного стандарта. В качестве стандартного раствора использован 1 мМ раствор аланина.

        Данные оптической плотности для расчета удельного содержания аминокислот:

        Далее необходимо учесть предварительное разведение образцов и отнести полученное значение к массе маточного молочка, содержащегося в пробе. В итоге получали значение, выраженное в мкмоль аминокислот/мг маточного молочка.

6. Разделение аминокислот методом бумажной хроматографии.

        Бумажная хроматография - один из видов распределительной хроматографии. Метод основан на различии коэффициентов распределения разделяемых веществ между двумя малосмешивающимися растворителями.

Оборудование.  Хроматографическая бумага, сосуд для хроматографии, электрическая плитка, сушильный шкаф, пульверизатор.

Реактивы. Элюирующий раствор (н-бутиловый спирт - уксусная кислота – вода -4:1:5), растворы аминокислот-свидетелей (аланин, аргинин, тирозин, валин, фенилаланин, 10мг/мл), исследуемая смесь, 0,2 % раствор нингидрина в ацетоне.

Ход работы.  На полоске хроматографической бумаги на расстоянии 1 см от края по ширине проводили стартовую линию. На стартовой линии на расстоянии 1 см от краев и друг друга отмечали точки нанесения образцов. Капилляром наносили по 2-3 мкл аминокислот-свидетелей и исследуемого раствора, диаметр пятен не превышал 2 мм. В сосуд для хроматографии наливали элюирующий раствор высотой 2-3 мм и помещали хроматографическую бумагу с нанесенными образцами. Хроматографировали до тех пор, пока фронт растворителя не достиг расстояния 1 см от верхнего края бумаги. Затем бумагу высушивали в строго горизонтальном положении над раскаленной плиткой. Высушенную хроматограмму проявляли. Для этого хроматографическую бумагу, находящуюся в вертикальном положении, опрыскивали из пульверизатора раствором нингидрина. Хроматограмму высушивали под тягой и помещали в сушильный шкаф (температура 60-70оС) на 5-10 мин. Рассчитывали коэффициент подвижности (Rf) для каждой аминокислоты по формуле:

 Rf = расстояние анализируемого соединения от старта / расстояние фронта растворителя.

В приложение (таблица 8) приводятся Rf  некоторых аминокислот.

Результаты и выводы

         В результате проведенной нами экспериментальной работы были получены следующие данные. В составе   исследуемых образцов препаратов присутствуют белки, на это указывает качественная реакция  на пептидные связи (биуретовая).

Содержание белка определенное методом Лоури показало, что препа-

рат-I содержал 427 мкг/мл белка, в препарате-II содержание белка было несколько ниже и составило 302 мкг/мл, что составляет 21,35% и 15,1% от массы маточного молочка соответственно (см. приложение, таблица 6). Полученные данные свидетельствуют о большей пищевой ценности препарата, произведенного Российской компанией.

Содержание пептидов в препарате-I составило 0,477%, в препарате-II 0,384% (см. приложение, табл.7). Поскольку спектр биологического действия пептидов к настоящему времени полностью не раскрыт, можно предположить, что большинство лечебных эффектов связано именно с их действием. А значит, препарат, произведенный ЗАО «Вифитех», потенциально обладает большим спектром фармакологически-значимых эффектов.

Анализируемый образец препарата Апилак (ЗАО «Вифитех») содержит 20 мкмоль аминокислот/мг препарата; анализируемый образец препарата Апилак (Grindex) содержит 12 мкмоль аминокислот/мг препарата.

        Для  разделения аминокислот использовали метод бумажной хроматографии. После проявления хроматограммы были обнаружены следующие особенности: каждому нанесенному образцу-свидетелю соответствовало индивидуальное пятно. Анализируя взаимное расположение пятен аминокислот - свидетелей было выявлено отсутствие совпадений их Rf, т. е. каждое пятно имело индивидуальный пробег от общей линии старта. В анализируемом образце «Апилак» ЗАО «Вифитех» после проявления хроматограммы обнаружилось не менее девяти пятен, из которых четыре удалось идентифицировать. Им соответствовали аминокислоты лизин, треонин, валин, метионин. В анализируемом образце «Апилак» Grindex  после проявления обнаружилось не менее пяти пятен, три из которых удалось идентифицировать. Им соответствовали аминокислоты лизин, фенилаланин, метионин. Не идентифицированным пятнам могут соответствовать другие протеиногенные или минорные аминокислоты. Исходя из общей картины хроматографического разделения аминокислот можно заключить, что препарат Апилак производства ЗАО «Вифитех» более ценен с позиции пищевых свойств, так как имеет более богатый спектр незаменимых аминокислот.

Заключение

         В результате проведенной  нами экспериментальной работы мы убедились, что маточное молочко, как и другие продукты пчеловодства, имеет сложный химический состав. Аминокислотный состав препаратов «Апилак»  разных производителей не одинаков. При правильном применении маточное молочко может оказать неоценимую помощь нашему организму.  

Литература

1. Габриелян О.С.  Химия. 10 класс. М.:  Дрофа, 2009.

2. Ленинджер А. Биохимия. Т.1-3. М.: Мир, 1985

3. Сметанин В.А., Петрушова О.П. и др. Лабораторный практикум по биологической химии. Пенза, 2007

 4. Соловьев В.Б., Сметанин В.А., Генгин М.Г. Практикум по методам биохимических исследований.  Пенза, 2009.

5. Филиппович Ю.Б/ Практикум по общей биохимии/ Ю.Б. Филиппович, Н.В. Васильева, Т.А. Егорова – М.: Просвещение, 1982.- 248 с.

6. Энциклопедический словарь юного химика.- М.: Педагогика, 1990.

 7. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. №1. P. 265-275.

8. http // ru.wikipedia.org/wiki

Приложение

Содержание витаминов в мкг на 1 г свежего маточного молочка

                                                                Таблица №2        

 Состав маточного молочка, % на сухой вес, кроме влажности

                                                        Таблица №3        

Колориметрическое определение общего белка методом Лоури

Калибровочная кривая

Таблица №4

Контрольные пробы:

К1=0,028        К2=0,029      К3=0,027       Кср=0,028

Данные для построения калибровочной кривой

Таблица №5

Δ=Dcp - Kcp

Рисунок 1. Калибровочный график

Методом регрессионного анализа на ЭВМ получено уравнение кривой вида:

D(C)=0,0038691C Расчетные формулы:

, где: P – разведение; С – концентрация белка

Содержание белка в маточном молочке

Таблица №6

Содержание низкомолекулярных пептидов

Таблица №7

Rf Аминокислот

Таблица №8