ДИПЛОМНАЯ РАБОТА
творческая работа учащихся на тему

Государственное бюджетное профессиональное образовательное

учреждение Департамента здравоохранения города Москвы

«Медицинский колледж № 1»

ГБПОУ ДЗМ «МК №1»

Выпускная квалификационная работа

Изучение возможностей масс-спектрального анализа в современной бактериологической лаборатории

Специальность34.02.01 Сестринское дело, базовая подготовка

                       Работу выполнил

                                                 Ф.И.О. Демешко Алексей Юрьевич

                           Курс  4    группа    41      

                                                               Руководитель

                                                               Ф.И.О. Давыдова Ирина Владимировна

                                                                Рецензент

                                                     Ф.И.О. Терещенко Инна Васильевна  

Москва, 2016 год      

Содержание.

Введение …………………………………………………………………….   3

Глава 1 Теоретическая часть………………………………………………     5

1. История развития бактериологии…………………………………    5

1.2 Общие понятия о бактериологической лаборатории……………     6

      1.3 Основные задачи  бактериологической лаборатории…………...     9
      1.4 Современные методы диагностики в бактериологических
            лабораториях....................................................................................     11
     1.5.История развития масс-спектрометра……………………………...   14

  Глава 2 Практическая часть………………………………………………...  16

      2.1 Традиционная схема выделения бактерий рода Staphylococcus…… 17
      2.2  Bactec ALERT 3D……………………………………………………... 25
     2.3 Mасс-спектрометр( MALDI Biotyper )Microflex…………………….  26
      2.4 Принцип работы на Miсflex.................................................................... 30

Заключение…………………………………………………………………….. 37

Список используемой литературы………..………………………………….. 38

Введение.

Микробиологические исследования имеют приоритетное развитие среди других видов лабораторной диагностики. Это обусловлено быстрым распространением инфекционных заболеваний, бесконтрольностью применения антибиотиков и антисептиков, востребованностью этого   лабораторной диагностики бактерий  практически при  всех видах медицинской помощи.

 Наблюдающийся рост инфекционных заболеваний, опасность возникновения и распространения внутрибольничных инфекций, широкое применение в лечебной практике антибактериальных препаратов требуют новых подходов к организации микробиологической    диагностики в многопрофильных лечебно-профилактических учреждениях.

     В последние годы у нас в стране достаточно активно внедряются в практику новые методы микробиологической диагностики на базе автоматизации и использования геномных и протеомных технологий:
- Масс-спектрометрия,
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР) + масс-спектрометрия и др.

     При использовании классической схемы  микробиологической диагностики, включающей в себя посев на плотные и жидкие питательные среды, выделение чистых культур, выявление ферментативной активности бактерий, фаготипирование и пр. результат исследований возможно получить  не ранее чем через  2-7 дней.

      Метод масс-спектрального анализа в диагностике микроорганизмов – это революционная разработка в области бактериологии, которая  за несколько секунд оценивает наличие уникального набора белков неизвестного микроба и позволят определить  его  род и вид в течение нескольких минут.

     Целью данной работы является изучение возможностей масс-спектрального анализа в современной бактериологической лаборатории.

     Задачи для достижения поставленной цели необходимо:

1. Изучить данные литературных источников о возможностях прямой идентификации микроорганизмов при применении масс-спектральных технологий.
2. Изучить  алгоритм исследования бактерий при использовании системы Microflex.
3. Сравнить классические методы диагностики бактерий и современный метод масс-спектральной идентификации, определить  преимущества новой технологии.

Объект исследования: масс-спектрометрический анализ.
Предмет исследования: возможности масс-спектрометрии в бактериологической лаборатории.
Использование современных решений в медицинских учреждениях позволяет значительно повысить надежность и своевременность диагностики, а следовательно и эффективность отечественного здравохранения в целом.

Что же представляет собой современная бактериологическая лаборатория по сравнению с баклабораторией прошлого века?
Это высокоавтоматизированная система микробиологической диагностики.

Глава 1.

1. История развития бактериологии.

Микробиология – относительно молодая наука, ее история насчитывает немногим более 300 лет.
В истории микробиологии можно выделить три периода:морфологический, физиологический и современный.
Морфологический период развития микробиологии связан с именем голландского ученого Антония ван Левенгука(1632-1723), который в конце  XVII века с помощью изготовленного им самим микроскопа, дающего увеличение в 300 раз, открыл мир микробов. Этот ученый издал первый научный трактат по микробиологии (1695) «Тайны природы, открытые Антони ван Левенгуком». К настоящему времени собрано 20 объемных томов рукописей Левенгука, в которых он описывает палочковидные, шаровидные, извитые и другие формы микроорганизмов, обнаруженных в различных объектах.[1]
Первым исследователем микроорганизмов в России был врач-микробиолог М.М. Тереховский (1740-1796). В своей работе «О наливочном хаосе Линнея» он экспериментально отверг теорию о самопроизвольном зарождении жизни.
Со второй половины ХIХ века началось бурное развитие микробиологии – физиологический период, связанный с именем величайшего французского ученого, химика по образованию, Луи Пастера (1822-1895). В истории мировой науки трудно найти другого исследователя, чьи работы имели бы такое теоретическое значение и вместе с тем дали бы такой большой практический эффект. К.А. Тимирязев считал, что «Пастер оказал такое влияние на практические стороны человеческой деятельности, какое не оказывал ни один человек за всю историю цивилизации»
Основной заслугой Пастера является то, что он впервые связал микроорганизмы с процессами, ими вызываемыми. Исследования Пастера завершили многовековой спор о возможности самопроизвольного зарождения жизни. Он экспериментально доказал, что в питательных средах, в которых убиты микроорганизмы, жизнь не зарождается даже при соприкосновении с воздухом, если в последнем они отсутствуют. 
В  XIX веке интенсивная работа по медицинской микробиологии начала проводиться во многих странах. Так, в развитие микробиологии большой вклад внес немецкий врачРоберт Кох (1843-1910), которым была разработана методика получения чистых культур микроорганизмов в виде отдельных колоний на плотных питательных средах, что позволило выделить и изучить ряд микроорганизмов. Р. Кохом разработаны также методы окрашивания микроорганизмов, микрофотографии, дезинфекции; введено в лабораторную практику заражение подопытных животных для выделения чистых культур патогенных микробов. Р. Кох обнаружил и изучил возбудителя туберкулеза человека и крупного рогатого скота (палочку Коха). Таким образом, Р. Кох заложил основы современной методики микробиологических исследований, за что в 1905 г. Шведская академия наук присудила ему Нобелевскую премию.
Современный период развития микробиологии.
По мере накопления знаний по микробиологии возникли специальные разделы микробиологии.
Общая микробиология изучает строение, закономерности развития и жизнедеятельности микроорганизмов, их изменчивость и наследственность, экологию, обмен веществ. Из общей микробиологии выделились: почвенная и водная микробиология, сельскохозяйственная, геологическая, космическая, медицинская микробиология и вирусология. Обширный раздел составляет техническая или промышленная микробиология, которая изучает микроорганизмы, используемые в производственных процессах, для  получения различных практически важных веществ: пищевых продуктов, этанола, глицерина, ацетона, органических кислот и др. [2]
В настоящее время микробиология стала не только фундаментальной наукой – в стране плодотворно работают научно-исследовательские учреждения по многим разделам микробиологической науки.

                   1.2 Общие понятия о бактериологической лаборатории.
Бактериологическая лаборатория — научно-практическое учреждение, выполняющее бактериологические, иммунологические и другие микробиологические исследования.[1]

Рисунок 1.Бактериологическая лаборатория.

Бактериологические лаборатории как самостоятельные структурные единицы организуются при санитарно-эпидемиологических станциях (СЭС), в инфекционных больницах, больницах общего типа, некоторых специализированных стационарах (например, в туберкулёзных, ревматологических, кожно-венерологических) и в поликлиниках.[1]
 Бактериологические лаборатории при СЭС исследуют на общую бактериальную загрязнённость, а также на заражённость условно патогенной и патогенной микрофлорой объекты внешней среды: воздух, воду, почву продукты питания; проводят обследование организованных коллективов и отдельных лиц на носительство патогенных бактерий кишечной группы, коринебактерий дифтерии, коклюша, паракоклюша, менингококка. Работа микробиологической лаборатории в комплексе с другими отделами СЭС имеет определённую задачу— оздоровление окружающей среды и снижение заболеваемости населения.
В состав крупной бактериологической лаборатории входят:
1.Собственно лаборатория
2.средоварня
3.моечная
4.препараторная
5.стерилизационная и виварий
Помещение бактериологической лаборатории  должно быть светлым и просторным. Над умывальником укрепляют бутыль с раствором для дезинфекции рук. Рабочие столы покрывают линолеумом или стеклом. На столе помещают газовую или спиртовую горелку, банку для использованных пипеток с 3% раствором карболовой кислоты, сосуд для ваты, бактериальную петлю, набор бактериальных стандартов, штативы для пробирок, кюветы, пинцеты, ножницы, скальпель, предметные и покровные стекла.
Бактериологическая лаборатория   должна быть снабжена баками для сброса инфицированной посуды. Обычно в бактериологической лаборатории  оборудуют специальный столик для окраски препаратов.
В бактериологической лаборатории , кроме обычной химической посуды, необходима специальная посуда:
1.Стеклянные чашки Петри (для выращивания бактерий на плотных средах); 2.Бактериальные матрацы (для получения больших количеств микробной массы)
3. Вассермановские пробирки длиной  90 мм и внутренним диам.  9 — 10 мм для постановки РСК и реакции агглютинации;
4.  Преципитационные пробирки  длиной  90 мм и диам. 3—5 мм; 5.Бактериальные пробирки  (для выращивания бактерий на жидких и плотных питательных средах);
6.Пастеровские пипетки;
7. Пипетки Мора (для засева инфицированного жидкого материала);
8. Автоматические пипетки или пипетки с грушами, исключающие насасывание материала ртом.
Посуда, используемая в бактериологической лаборатории  , должна быть выщелочена в 1—2% растворе НCl и простерилизована при помощи высокой температуры. Посевы на плотных питательных средах производят при помощи стеклянных шпателей и бактериальной петли . Выращивают бактерии в термостатах или термостатных комнатах.

Персонал во время работы должен строго соблюдать следующие правила:

1) находиться в лаборатории можно только в специальном халате и шапочке;
2) в лабораторию нельзя вносить посторонние вещи, хранить там продукты, принимать пищу;
3) исследуемый  материал поступающий в лабораторию, рассматривается как заразный; его ставят на специальный поднос и обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором;
4) во время работы необходимо соблюдать осторожность, следить за чистотой рук, применять технические приемы, исключающие контакт с заразным материалом;
5) исследуемый материал, отработанные культуры подлежат уничтожению;
6) по окончании работы руки, инструменты, рабочее место обрабатывают дезинфицирующим раствором. Культуры микробов, необходимые для дальнейшей работы, ставят в холодильник или сейф и опечатывают.
Уборка помещений лаборатории.
Уборку проводят ежедневно до и после работы влажным способом с применением дезинфицирующих средств. Пол протирают 2— 5% раствором карболовой кислоты или хлорамина. Стены, инвентарь и полы один раз в неделю моют горячей водой с мылом. Бокс убирают в конце рабочего дня, а утром перед работой облучают бактерицидными лампами. Посуду, содержащую заразный материал и культуры микробов, обеззараживают в автоклаве.
Нельзя обрабатывать посуду дезинфицирующим раствором, так как даже следы его задерживают рост микробов.
Стеклянную посуду моют ершами с применением бикарбоната натрия, полужидкого мыла или стирального порошка.Новую лабораторную посуду кипятят 15 мин в воде с мылом, прополаскивают, погружают в теплый 1—2% раствор хлористоводородной кислоты и кипятят 10—15 мин. В пипетки вводят кусок проволоки, на конец которой плотно накручивают кусок ваты, и тщательно протирают их. Предметные и покровные стекла должны быть хорошо обезжирены (нанесенная на стекло капля воды должна растекаться). Стекла ,  бывшие в употреблении,  загрязненные краской и маслом, опускают на 2 ч в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, затем промывают проточной водой и кипятят в 5% растворе бикарбоната натрия 30—40 мин. Вымытую  посуду ставят в сушильный шкаф или сушат на воздухе, пробирки закрывают пробками из ваты, заворачивают в бумагу и стерилизуют в сушильном шкафу или печи Пастера.  
Исследования,проводимые в бактериологических лабораториях:
Бактериологические лаборатории при лечебно-профилактических учреждениях выполняют анализы, необходимые для постановки и уточнения диагноза инфекционного заболевания, способствуя правильному выбору специфического лечения и определению сроков выписки больного из инфекционной больницы. Предметом для исследования в бактериологических лабораториях являются:выделения из организма человека:моча,  кал, мокрота, гной, а также кровь, спинномозговая жидкостьи трупный материал;объекты внешней среды: вода, воздух, почва, продукты питания, смывы с предметов инвентаря, рук и т.п.
Оснащение микробиологической лаборатории современными автоматизированными системами значительно улучшает качество микробиологических исследований и сокращает сроки их проведения. [3]

1. 3 Основные задачи  бактериологической лаборатории.

       Основная задача современной бактериологической лаборатории заключается в оптимизации алгоритма микробиологических исследований для того, чтобы в кратчайшие сроки подтвердить диагнози выявить наиболее эпидемиологически опасные случаи. Высокая изменчивость микроорганизмов вынуждает лабораторию всегда быть начеку; цена ошибки – не только здоровье и жизнь пациента, но и эпидемиологическое благополучие региона. Ежедневно микробиологи встречаются с целым рядом проблем, которые влияют на эффективность микробиологических исследований: рост стоимости лечения, неверное применения антибиотиков, бич современности –внутрибольничные инфекции, рост антибиотико-резистентности микроорганизмов. Вместе с тем, растут и требования к качеству результата микробиологического анализа – быстрее, информативнее, надёжнее. .[4]   
Бактериологические лаборатории при лечебно-профилактических учреждениях выполняют анализы, необходимые для постановки и уточнения диагноза инфекционного заболевания, способствуя правильному выбору специфического лечения и определению сроков выписки больного из инфекционной больницы. Предметом для исследования в бактериологических лабораториях являются:выделения из организма человека:моча,  кал, мокрота, гной, а также кровь, спинномозговая жидкостьи трупный материал;объекты внешней среды: вода, воздух, почва, продукты питания, смывы с предметов инвентаря, рук и т.п.
Обращаясь в бактериологическую лабораторию, пациент может рассчитывать на проведение разнообразных анализов, нужных для правильной диагностики, а также оценки динамики инфекционных заболеваний. Чаще всего только при наличии анализов, проведенных в бактериологической лаборатории, можно определить схему и длительность лечения.
Этапы микробиологического исследования.
Традиционные этапы микробиологического исследования:
1.Забор и транспортировка материала.
2. Посев на агаровые культуральные среды разной селективности.
3. Инкубирование для изоляции и/или накопления «чистой» культуры микроорганизмов.
4. Идентификация культур.
5. Определение чувствительности культур к АБП.
6. Утилизация или хранение культур.
Основной целью являются этапы 4 и 5, поскольку именно они определяют диагностику и дальнейшее лечение. Общая длительность процесса занимает от 2–3х суток до нескольких недель и в целом зависит от биологических свойств микроорганизмов и ростовых свойств используемых культуральных сред

               1.4Современные методы диагностики в бактериологических                            лабораториях.

В настоящее время этапы бактериологической диагностики претерпевают ряд изменений, так как место традиционных методик занимают методики с использованием современных аппаратов, позволяющих проводить идентификацию микроорганизмов значительно быстрее.
Очень многие процессы автоматизированы. Модернизации подверглись процессы приготовления питательных сред, и процессы окраски мазков микроорганизмов и даже сам посев на чашку петрии сегодня могут выполнить машины.
Существует огромное количество анализаторов,производящих быструю идентификации патогенных бактерий. Одним из таких анализаторов является прибор BacTALERT 3D.

Идентификация микроорганизмов с помощью BacTALERT 3D.

Рисунок 2. BacTALERT 3D.

BacTALERT 3D-это полностью автоматезированная система для выясления микробиологических культур, осуществляющая инкубацию, взбалтывание  и непрерывный сбор информацииоб аэробной и анаэробной среде,содержащий образец крови пациента , на предмет выявления в этой сфере бактерий или гематогенной грибковой инфекции. [2]

    Система BacTALERT 3Dявляется гибкой модульной системой , включающей от 1 до 6 инкубационных модулей,управляемых модулями контроллера  . Эта система не нуждается в радиоктивных реагентах,газовых балонах и не загрязняет окружающую сред. [3]
Модуль контроллера оборудован сенсорной панелью управления,благодаря чему  загрузка и  разгрузка образцов производится быстро и не требует ввод информации в виде текста.[4]

Рисунок 3. Инкубационные модули системы BacTALERT 3D.

Рисунок 4.Сенсорной панель системы BacTALERT 3D.
После внесения флакона с образцом ручные операции не требуются вплоть до окончания анализа,то есть до ответа на вопрос ,положительна или отрицательна. Если результат положительный,то сообщение об этом немедленно появится на дисплее или в виде  звукового сигнала.
Результат считается отрицательным, если по истечению заданного времени роста микробиологической культуры не обнаружены.По запросу система показывает, акие образцы дали отрицательный результат и,следовательно, могут быть удалены.
Одноразовые флаконы[5], содержащие микробиологическую культуру,оборудованы чувствительным материалом –датчиком наличия углекислого газа (СО2),выходная информация которого непрерывно анализируется твердотельными рефлектометрами. Для упрощения индетификации в отслеживании образцов в системе предусмотрено маркирование штрих-кодом.

Рисунок 5. Штрих-код на флаконах.

Для определения колличества углекислого газа, содержащегося в среде, в системе BacTALERT 3Dимеется коллометрический датчик. Наличие СО2  означает присутствие в образце микроорганизмов.  По мере накопления СО2 цвет чувствительного материала в нижней части флакона изменяется с желтого на зеленый. Чем больше в образце накопилось углекислого газа,тем выше интенсивность отраженного света.
BacTALERT 3D осуществляет инкубирование,взбалтывание и непрерывный сбор информации о состоянии микробиологической культуры, находящейся во флаконе, с помощью твердотельного рефлектометра.В каждом образце  прибора этой  системы имеется по кране мере один инкубированный модуль.Каждый модуль контроллера может управлять до 6 инкубационнными модулями. .[9]

Флаконы BacTALERT 3D

Одноразовые флаконы со стерильной культурной средой, к которой следует добавить  испытуемый образец. В каждом флаконе имеется чувствительный элемент, обнаруживающий двууглекислый газ, оторый выделяется как продукт жизнедеятельности бактерий при их росте. [6]
Срок годности проставлен на каждом флаконе.

Рисунок 6.Флаконы BACTEC

Загрузка флаконов:
1. Для начала нужно автоматичеси или вручную ввести идентификационный номер каждого загружаемого флакона.
2.Тип флакона,который можно загрузить высвечивается на индикаторах штатива ,содержащий ячейки,доступные для загрузки, зеленым цветом
3. Имеется возможность вручную или автоматически ввести  номер пациента.
4.Открыть один из штативов , отмеченных зеленым цветом . Индикаторы  на ячейках  показывают ,которые из них готовы к загрузке
5. Загрузить флакон в ячейу, отмеченную индикатором. Загрузка подтверждается миганием индикатора

6.По окончании загрузки удостовертесь ,что все штативы  плотно закрыты и нажать нужную нопку на экране.

  Выгрузка флаконов и другие ручные операции могут повлиять на результат последующих анализов и привести к ошибкам, если конечно, результат не был зафиксирован  системой до начала этих операций.

Одним из  самых современных анализаторов является прибор, принцип работы которого основан на масс-спектральном анализе Microflex.

1.5.История развития масс-спектрального анализа

В конце XX столетия из всех ежегодно производимых в мире приборов для научных исследований на долю масс-спектрометров приходилось около 5%. Нашедшая первоначально свое применение в физике изотопов, масс-спектрометрия в настоящее время – один из наиболее широко используемых методов в химии, геологии, биологии и других областях науки.

В 1912 году английский физик Дж. Дж. Томсон[7], используя свой прибор – первый прототип будущих масс-спектрометров, впервые разделил различные массовые компоненты химических элементов.

В настоящее время известно, что существует также и третий изотоп – 10Ne21. Таким образом, впервые были измерены массы.

 различных изотопов, то есть атомов одних и тех же элементов, но с различными массами.

  Рисунок 7.Дж. Дж. Томсон

Несколькими годами позже Ф.У. Астоном [8] было открыто 212 стабильных изотопов различных элементов, а масс-спектрометрия и по сей день остается основным методом определения масс ядер.

 В 80-е годы был найден метод перевода в газовую фазу нелетучих органических соединений в виде ионов, и масс-спектрометрия превратилась в универсальный метод определения молекулярных масс больших молекул, несмотря на то, что

большинство из них претерпевают деструкцию при термическом нагреве. [15]

Рисунок 8.Ф.У. Астоном.

К 1991 году был осуществлен принципиально новый   подход к ионизации нелетучих соединений с сохранением их молекулярной целостности, то есть без термической деструкции больших молекул.

Почти все крупнейшие фирмы научного приборостроения заинтересованы в выпуске используемых для этого метода приборов.

В начале 21 столетия ученый из Японии Танака [9]разработал  метод масс-спектрального анализа  для исследования биологических макромолекул   и в 2002 году ему  была присуждена Нобелевская премия.
И Метод стал активно применяться в бактериологии.[15]

Рисунок 9.ученый из Японии-Танака

Глава 2. Практическая часть

Современная бактериологическая лаборатория значительно отличается от баклаборатории прошлого века. Применение новых питательных сред, приборов для культивирования, новых диагностических аппаратов позволяют существенно сократить время диагностики и улучшить достоверность анализа. Автоматизация затронула все сферы микробиологической диагностики, начиная от ламинарных боксов для создания стерильных условий и заканчивая современными методами утилизации биоматериала.

Использование современных решений в медицинских учреждениях позволяет значительно повысить надежность и своевременность диагностики, а следовательно и эффективность отечественного здравохранения в целом.

Что же представляет собой современная бактериологическая лаборатория по сравнению с баклабораторией прошлого века?
Это высокоавтоматизированная система микробиологической диагностики.

         В настоящее время в России и за рубежом активно развиваются новые подходы к диагностике инфекционных заболеваний, использующие достижения и методы протеомики - области современной биологии, занимающеися инвентаризациеи белков живых организмов, изучением их экспрессии и взаимодеиствия в клетке в различных физиологических состояниях.

Автоматизация некоторых приемов микробиологической диагностики  значительно улучшила качество лабораторной идентификации микроорганизмов и сократила период ожидания результата.  

Например, определение микроорганизмов  рода стафилококк можно выделять по традиционной методике, с помощью апппарата Bactec и используя масс-спектрометр  Микрофлекс.

2.1 Традиционная схема выделения бактерий рода Staphylococcus

Микробиологические методы идентификации микробов рода стафилококка (Staphylococcus)
Род Staphylococcus относится к семейству Micrococcaceae, в которое входят также роды Micrococcus и Planococcus. Общими чертами представителей этого семейства являются:
1) морфология микробных клеток - все они грамположительные микроорганизмы сферической формы, делящиеся более чем в одной плоскости,
2) наличие фермента каталазы.
Согласно решению Международного подкомитета по таксономии стафилококков и микрококков (Варшава, 1975 г.) род Staphylococcus состоит из 3 видов: S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus. Представители двух последних видов относятся, к так называемым, коагулазоотрицательным стафилококкам, которые долгое время считались непатогенными. Сейчас эту точку зрения следует считать опровергнутой. Доказано, что S. epidermidis может вызывать такие заболевания как эндокардит, сепсис, конъюнктивит, инфекцию ран и мочевыводящих путей, a S. saprophyticus - острый уретрит и цистит.
Целью первичной идентификации является установление принадлежности выделенной культуры к семейству Micrococcaceae и роду Staphylococcus.
Для установления принадлежности культур к семейству микрококков (Micrococcaceae) используют тест на каталазу.
Отмечают способность представителей семейства микрококков, имеющих фермент каталазу, расщеплять перекись водорода, образуя воду и газообразный кислород.
В отличие от микрококков, представители родственного семейства стрептококков каталазы не имеют.
Установление принадлежности культуры к роду Staphylococcus.
На этом этапе исследования применяются методы, позволяющие дифференцировать стафилококки от микрококков. К их числу относятся культуральный, бактериоскопический и биохимический методы, из которых последний является главным.
Культуральный метод.
Основным отличием стафилококков от микрококов является окраска колоний на плотной среде. Для стафилококков характерны золотистые (от палевых до ярко-золотистых) или белые колонии. У микрококков колонии окрашены, как правило, в желтый (с различными оттенками - от желто-зеленого до оранжевого) или розовый (вплоть до красного) цвета. Дополнительным тестом может служить характер роста на плотной кровяной (5% дефибринированной крови барана или кролика) среде. Подавляющее большинство штаммов S. aureus и некоторые штаммы S. epidermidis растворяют эритроциты, образуя прозрачную зону гемолиза вокруг колоний. Микрококки гемолитическими свойствами не обладают.
Бактериоскопический метод.
В мазках, окрашенных по Граму, стафилококки располагаются по одиночке, парами или в виде скоплений (гроздей) неправильной формы. Для микрококков, помимо указанных вариантов, характерно также образование тетрад и пакетов. Размеры микробных клеток у микрококков, как правило больше (диаметр 0,5-3,5 мкм), чем у стафилококков (диаметр 0,5-1,5 мкм).
Определение ферментации глюкозы в анаэробных условиях.
Стафилококки являются факультативными анаэробами, микрококки - облигатными аэробами. В связи с этим стафилококки способны расти и ферментировать глюкозу в анаэробных условиях, микрококки лишены этой способности.
Принцип. При ферментации глюкозы в анаэробных условиях образуется молочная кислота, в связи с чем среда закисляется и рН ее снижается. Закисление среды выявляется по изменению окраски индикатора, добавленного в среду./
Ингредиенты. Полужидкие среды (0,3% агар), содержащие 1% глюкозы - это готовая среда с индикатором ВР или среда Хью-Лейфсона с индикатором бромтимоловым синим. Последняя среда является более чувствительной, т.к. изменение ее окраски происходит при более высоких значениях рН, поэтому она позволяет выявить ферментацию глюкозы слабо активными штаммами вида S. saprophyticus. В связи с этим, если какой-либо штамм дал отрицательный результат на среде ВР, его следует повторно исследовать на среде Хью-Лейфсона.
Готовую среду разливают по 5 мл в пробирки и подвергают дробной стерилизации. Непосредственно перед посевом пробирки со средой помещают на 15 минут в кипящую водяную баню для удаления кислорода, а затем быстро охлаждают в ледяной бане.
Ход исследования
Суточную агаровую культуру исследуемого штамма с помощью бактериологической петли сеют в столбик среды уколом до дна пробирки, а затем на поверхность агара наливают 1,5 мл стерильного вазелинового масла для создания анаэробных условий. Посев инкубируют при 37°С в течение 5 суток, ежедневно регистрируя результаты. Реакция считается положительной, если происходит желтое окрашивание столбика среды, занимающее не менее 2/3 его высоты. Длительные сроки учета реакции представляют известные неудобства, поэтому на практике дальнейшую идентификацию стафилококков проводят, обычно не дожидаясь результатов анаэробной ферментации глюкозы. В этой связи результаты указанного теста как бы дополняют результаты других тестов, полученных на следующих этапах идентификации.
Видовая идентификация стафилококков.
Первым этапом исследования является дифференциация штаммов S. aureus от представителей двух коагулазотрицательных видов стафилококка. Если установлено, что штамм не относится к виду S. aureus проводят его идентификацию для выяснения принадлежности культуры к видам S. epidermidis или S. saprophyticus.
Идентификация S. Aureus.
Ориентировочные данные о принадлежности культуры к виду можно получить при изучении характера колоний, выросших после посева исходного материала на элективную среду стафилококков - молочно-желточный солевой агар (МЖСА).
Среда для определения лецитоветиллазы (лецитиназа).
Принцип. Хлористый натрий является элективным фактором, т.к. подавляет рост большинства представителей другой микрофлоры, главным образом, грамотрицательной. Одним из компонентов яичного желтка является лецитовителлин.
Лецитовителлин является субстратом для фермента лецитовителлазы (лецитиназы), относящегося к группе липаз и продуцируемого некоторыми стафилококками. При расщеплении лецитовителлина вокруг лецитиназоположительной колонии на поверхности среды образуется радужный венчик. Добавление в среду молока путем сложных химических процессов стимулирует образование стафилококками золотистого или лимонно-желтого пигмента, относящегося к группе каротиноидов.
Ингредиенты. Основой среды является 1,8% питательный агар, содержащий 7,5 г NaCl на 100 мл среды. К 200 мл растопленного и охлажденного до 50°С агара добавляют молочно-желточную смесь, которую готовят следующим образом: во флаконе с 20 мл стерильного снятого молока эмульгируют (со стеклянными бусами) 2 мл яичного желтка. После добавления смеси в агар среду тщательно перемешивают и разливают примерно по 20 мл в чашки Петри. Готовая среда содержит =10% молока и 1% яичного желтка.
Ход исследования.
Для выявления лецитиназы достаточно инкубации посева в течение 18-24 часов при 37°С. Выявление пигмента у колоний в ряде случаев требует дополнительной инкубации в течение 18-24 часов при комнатной температуре. О наличии лецитиназы свидетельствует, как уже было отмечено, образование вокруг колонии радужного венчика. Наличие пигмента легко определяется на глаз.
Как правило, штаммы S. aureus, обладают лецитиназой и пигментом, а культуры двух других видов лишены их. Возможны, однако, исключения: некоторые штаммы S. aureus не имеют пигмента или лецитиназы, а ряд штаммов S. epidermidis обладает лецитиназной активностью.
Окончательная идентификация S. aureus требует постановки еще 2 тестов. На первом этапе определяют наличие у штаммов плазмокоагулазы. Если после этого штамм идентифицировать не удается, дополнительно определяют один из двух следующих признаков: наличие ДНК-азы (что предпочтительнее) или способность ферментировать маннит в анаэробных условиях. При наличии положительного результата в реакции плазмокоагуляции и хотя бы в одном из двух предварительных тестов (пигмент, лецитиназа) исследуемый штамм может быть отнесен к виду S. aureus (варианты 1-3). Отсутствие плазмокоагулазы и хотя бы одного из первых двух признаков дает основание считать, что штамм не принадлежит к S. aureus (варианты 5-7). Расхождения между результатами реакции плазмокоагуляции, с одной стороны, и двух предварительных тестов - с другой (варианты 4 и 8) требуют постановки одного из двух дополнительных тестов (ДНК-аза или ферментация маннита в анаэробных условиях). В случае совпадения результатов дополнительного теста с результатами реакции плазмокоагуляции штамм считается либо относящимся к виду S. aureus (при положительных результатах, варианты 4а и 4в), либо не относящимся к нему (при отрицательных результатах, варианты 8б и 8г). При расхождении результатов реакции плазмокоагуляции и дополнительного теста вопрос решается с учетом большинства положительных (принадлежность к виду S. aureus, варианты 8а и 8в) или отрицательных (принадлежность к другим видам, варианты 4б и 4г) результатов. Проводить идентификацию S. aureus лишь на основании результата одного теста не рекомендуется.
Реакция плазмокоагуляции.
Принцип. Под действием фермента плазмокоагулазы активируется естественная система свертывания крови (плазминогенпротромбин).
Реактивы. Плазма кроличья, сухая, цитратная для реакции плазмокоагуляции, готовая.
При отсутствии сухой кроличьей, лиофилизированной плазмы готовят свежую плазму.
Приготовление свежей плазмы.
Стерильно взятую из сердца кровь кролика в количестве 8 мл вносят в пробирку с 2 мл стерильного 5% раствора лимоннокислого натрия, смешивают и центрифугируют для осаждения форменных элементов крови в течение 10 минут при 1500 об/мин. Плазму отсасывают, разводят в 5 раз стерильным физиологическим раствором и разливают в стерильные пробирки по 0,5 мл.
Ход исследования
В пробирку вносят 1 петлю суточной агаровой культуры исследуемого штамма, которую суспендируют в плазме. Штатив с пробирками помещают в термостат при 37°С и регистрируют результаты реакции через 1, 2, 4 и 18 часов инкубации.
Оценка результатов
Появление на дне пробирки студнеобразного сгустка любого размера считается положительным результатом реакции. Положительным результатом следует считать наличие плазмокоагуляции в первые 4 часа инкубации. Отсутствие свертывания плазмы в течение 18 часов расценивается как отрицательный результат. В качестве контроля рекомендуется ставить реакцию с заведомо коагулирующим и некоагулирующим штаммами, а также оставлять одну пробирку с плазмой незасеянной.
Определение ДНК-азы
Принцип. Под действием ДНК-азы (дезоксирибонуклеазы) добавленная в плотную среду высокополимерная ДНК распадается на низкополимерные фрагменты. При этом мутная среда, содержащая высокополимерную ДНК, становится прозрачной.
Реактивы. Сухая высокополимерная ДНК; 2 моль/л раствор едкого натра (NaOH), 3 моль/л раствор соляной кислоты (НСl), стерильный 10%-ный раствор хлористого кальция (CaCl2). 50 мг, 100 мг или 200 мг высокополимерной ДНК растворяют в 3-5 мл дистиллированной воды, подщелоченной 4-5 каплями 2 моль/л NaOH. К 100 мл расплавленного 1,8% мясопептонного агара (рН 8,6) добавляют приготовленный раствор ДНК и прогревают среду 20 минут в кипящей бане. Затем в слегка охлажденный агар вносят 0,5 мл стерильного 10% раствора CaCl2, среду тщательно перемешивают и разливают тонким слоем в чашки Петри (по 10-12 мл на чашку), в зависимости от взятой дозы. Содержание ДНК в готовой среде составляет 0,5; 1,0 или 2,0 мг/мл.

Ход исследования
Суточную агаровую культуру исследуемого штамма засевают коротким (1-1,5 см) штрихом на поверхность подсушенного агара. На одну чашку можно посеять до 16 штаммов. После 18-24 часовой инкубации при 37°С поверхность агара заливают небольшим количеством (5-7 мл) 3 моль/л раствора НСl. Через 2-3 минуты кислоту сливают и регистрируют результаты.

Оценка результатов
Появление вокруг культуры прозрачной зоны (деполимеризация ДНК), которая в 4 и более раз превосходит по ширине зону микробного роста (ширина последней должна превышать 2-3 мм), свидетельствует о положительной реакции на ДНК-азу. Меньшая зона деполимеризации ДНК расценивается как сомнительная реакция и учету не подлежит.
Идентификация S. epidermidis и S. saprophyticus.
Те штаммы, которые после исследований, описанных в предыдущем разделе, признаны не относящимися к S. aureus, подвергаются дальнейшей идентификации для установления их видовой принадлежности.Дифференциацию S. epidermidis от S. saprophyticus рекомендуется проводить в 3 тестах: определение 1) устойчивости к новобиоцину, 2) фосфатазы, 3) способности окислять маннит. Упрощенная схема идентификации указанных видов представлена в таблице 4. Для штаммов S. epidermidis характерны: чувствительность к новобиоцину, наличие фосфатазы, неспособность окислять маннит, для штаммов S. saprophyticus - противоположные свойства. Поскольку не все стафилококки по своим характеристикам укладываются в указанную схему, такие штаммы следует обозначать Staphylococcus spp.

Определение устойчивости к новобиоцину.
Принцип. Антибиотик новобиоцин в избранной концентрации подавляет рост штаммов S. epidermidis, но не влияет на рост естественно устойчивых к нему штаммов S. sap rophyticus.
Ингредиенты. Из стерильного водного раствора новобиоцина (10 мг в 10 мл дистиллированной воды) берут 0,5 мл и вносят в пробирку с 3 мл стерильного физиологического раствора. Содержимое пробирки переносят во флакон с 250 мл расплавленного и охлажденного до 50°С 1,8% питательного агара, перемешивают и разливают среду в чашки Петри. Конечная концентрация новобиоцина в среде составляет 2 мкг/мл.

Ход исследования.
Одну каплю суточной бульонной культуры исследуемого штамма засевают с помощью петли на поверхность агара (на одну чашку можно сеять не менее 25 штаммов). Посевы инкубируют 24 часа при 37°С, регистрируют результаты. Рост штамма в виде крупной бляшки свидетельствует об его устойчивости к новобиоцину. Полное отсутствие роста или наличие небольшого числа отдельных мелких колоний дает основание считать штамм чувствительным к новобиоцину.
Тест на фосфатазу.
Определение фосфатазы можно проводить двумя методами, дающими совпадающие результаты, с использованием двух разных реактивов (в зависимости от наличия одного из них).
Принцип. Фермент фосфатаза отщепляет фосфатную группу от фосфорорганического соединения. Образующийся в результате продукт реакции либо уже является окрашенным, либо приобретает окраску при добавлении соответствующего реактива.. Динатриевая соль пара-нитрофенилфосфата (1-й метод); фенолфталеинфосфат натрия, 25% раствор аммиака (2-й метод).
Ход исследования.
1-й метод. 50 мг пара-нитрофенилфосфата (динатриевая соль) растворяют в 3 мл стерильной дистиллированной воды. Указанный раствор добавляют к 100 мл расплавленного и охлажденного 1,8% питательного агара, перемешивают и разливают в чашки Петри. Конечная концентрация реактива в среде составляет 0,05%. Суточные агаровые культуры исследуемых штаммов с помощью петли сеют на среду (не более 16 штаммов на одну чашку). Учет результатов проводят после 18-24 часовой инкубации при 37°С. Реакция считается положительной, если в толще среды вокруг выросшей колонии видна зона интенсивного желтого окрашивания.
2-й метод. Фенолфталеинфосфат натрия добавляют к агару в концентрации 0,01%. Посев и инкубация осуществляется так же, как и в предыдущем методе. По окончании инкубации на крышку чашки Петри наливают 5-6 капель 25% раствора аммиака, выдерживают чашку в перевернутом состоянии 5-10 минут, подвергая выросшую культуру воздействию паров аммиака, после чего регистрируют результаты. О положительной реакции свидетельствует появление розового окрашивания макроколоний.
Определение окисления маннита.
Принцип. При окислении маннита в аэробных условиях, образуется уксусная кислота, которая закисляет среду, что выявляется с помощью индикатора.
Ингредиенты. Для постановки опыта рекомендуется плотная (1,8% агара) среда с индикатором ВР и среда Хью-Лейфсона, содержащие 1% маннита. Среду разливают в чашки Петри.
Ход исследования.
Суточные агаровые культуры исследуемых штаммов сеют на среду бляшками (не более 16 штаммов на одну чашку). Посевы инкубируют при 37°С, результаты регистрируют через 1 сутки. Появление желтого окрашивания вокруг макроколонии свидетельствует о положительной реакции.
Фаготипирование штаммов S. Aureus
Для внутривидового дифференцирования S. aureus применяется метод фаготипирования, позволяющий получить фаговую метку большинства штаммов и с большей долей вероятности решить вопрос об идентичности или различии сопоставляемых культур, что очень важно для выявления источников и путей распространения стафилококковой инфекции.Принцип. Штаммы S. aureus обладают избирательной чувствительностью к литическому действию ряда стафилококковых бактериофагов, составляющих Международный набор типовых фагов. Чувствительность исследуемого штамма к одному или нескольким типовым фагам определяет фаготип штамма, т.е. его фаговую метку.
Схема идентификации стафилококков:
День 1.Посев исследуемого материала на МЖСА или кровяной агар.
День 2.
А. Учет наличия лецитиназы и пигмента (МЖСА), гемолиза (кровяной агар).
Б. Приготовление и просмотр окрашенных по Граму мазков.
В. Постановка и учет каталазной реакции.
Г. Отсев чистой культуры на косой агар.
День 3.
А. Окончательный учет наличия пигмента.
Б. Постановка теста на ферментацию глюкозы в анаэробных условиях.
В. Постановка реакции плазмокоагуляции и предварительный учет ее результатов.
Г. Отсев чистой культуры на бульон.
День 4
А. Учет ферментации глюкозы.
Б. Окончательный учет реакции плазмокоагуляции и сопоставление ее результатов с результатами определения лецитиназы и пигмента (см. табл. 3). В зависимости от этого:
а) при вариантах 1, 2 и 3 штамм идентифицируется как S. aureus - проводится фаготипирование;
б) при вариантах 5, 6 и 7 штамм не относится к S. aureus - проводится его дальнейшая идентификация: постановка тестов на устойчивость к новобиоцину (посев бульонной культуры), окисление маннита, тест на фосфатазу (посев агаровой культуры);
в) при вариантах 4 и 8 идентификация еще невозможна; постановка тестов на ДНК-азу или ферментацию маннита в анаэробных условиях.
День 5.
А. Предварительный учет ферментации глюкозы.
Б. Учет результатов фаготипирования S. aureus
В. Учет результатов определения устойчивости к новобиоцину, окисление маннита, фосфатазы; штамм идентифицируется либо как S. epidermidis, либо как S. Saprophyticus. Идентификацию можно считать окончательной при положительном результате анаэробной ферментации глюкозы.
Г. Учет результатов определения ДНК-азы при вариантах 4а и 8а (табл. 3) ход исследований тот же, что в пункте А дня 3; при вариантах 4б и 8б ход исследований тот же, что в пункте Б дня 3.
Д. Учет анаэробной ферментации маннита
День 6.
А. Учет ферментации глюкозы.
Б. Учет ферментации маннита.
В. Учет результатов фаготипирования S. aureus и результатов определения устойчивости к новобиоцину, окисления маннита, фосфатазы коагулазонегативных стафилоккокков (раздел Б, день 4).
День 7.
А. Окончательный учет ферментации глюкозы.
Б. Учет ферментации маннита.
День 8.
А. Окончательный учет ферментации маннита, далее ход исследований как в разделе Г дня 4. Если положительный результат ферментации маннита получен ранее, то сроки исследования сокращаются.
День 9.
Учет результатов (см. раздел В дня 5).
1. Среда Хью-Лейфсона
2. Среда с индикатором ВР и одним из углеводов -
3. Тест на каталазу

2.2. Bactec ALERT 3D.

С помощью BactecStaphylococcus в крови можно определить в среднем за 16 часов. Стандартный прибор применяется для диагностики детской крови из-за небольшого количества подобных проб, новой модели имеет два отделения, которые загружаются в зависимости от отделения в котором взят анализ. В случае положительного анализа прибор издает заметный звуковой сигнал, а ячейка с препаратом обозначается на дисплее, в новой модели она помимо всего этого обозначается мигающим красным сигналом, после извлечения пробы необходимо произвести её повторное сканирование. В случае отрицательного анализа, звуковой сигнал отсутствует, ячейка отображается как моргающий зеленый сигнал, повторного сканирования не проводят.[9]
Алгоритм определения крови на Staphylococcusв крови .
1.    В бактериологическом исследовании крови очень важен преаналитический этап. Кровь на бактериологическое исследование берется в начале лихорадки, так как с ее нарастание в крови уменьшается количество возбудителя, а концентрация его метаболитов повышается. После чего кровь носится в стерильный флакон с адсорбентом и питательной средой, в соотношении один к десяти (в качестве адсорбента выступает уголь или синтетический гранулированный заменитель)
2.    Флаконы помещают в BACTEC ™ (В ГКБ №12 вBacT/ALERT3D), где производится инкубация, с измерением оптической плотности раз в пятнадцать минут. Если во флаконе наблюдается рост возбудителя – анализатор это фиксирует. Активность может проявиться от нескольких часов до пяти суток.
3.    При положительном результате на BACTEC ™, проводят дальнейшее исследование. Проводится пересев из флакона на кровяной агар для выделения чистой культуры, а так же делается мазок который красится по Граму

2.3.  Mасс-спектрометр( MALDI Biotyper )Microflex.

Самый    современный метод в диагностике является метод масс-спектрометрии.
Масс-спектрометрия-это физический метод измерения массы ионов исследуемого вещества и их относительного количества
Он  используется для быстрой идентификации микроорганизмов и его внутривидовой классификации
Можно сказать, что масс-спектрометрия — это «взвешивание» молекул, находящихся в пробе.
Традиционно в лабораториях  применяют прибор Microflex системы MALDI BioTyper.
Уникальная система MALDI-TOF позволяет получить данные максимальной точности.
MALDI (матрично активированная лазерная десорбция/ионизация) представляет собой «мягкий» способ ионизации. Вспомогательная матрица снижает разрушительные свойства лазерного излучения, что обеспечивает ионизацию крупных биомолекул без деградации.
Применение системы MALDI-TOF BioTyper дает возможность тщательного и достоверного анализа вирусных штаммов, полиморфизмов, пептидов, полимеров. Сегодня этот метод является наиболее эффективным. Он позволяет с высокой вероятностью определить риск развития наследственных заболеваний, выявить наиболее эффективные пути лечения различных патологий, расширить круг известных медицине возбудителей болезней.
В микробиологии этот прибор позволяет с высокой точностью определить количественный и качественный состав вещества, его структуру, физико-химические реакции. [10]
В частности, используются для:

• идентификация микроорганизмов в биологических средах — мицелиальных грибов, дрожжей, грамположительных и грамотрицательных бактерий,
• видового типирования бактерий — выявления их родовой и видовой принадлежности,
• определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам,
• создания генетического паспорта человека.
  Масс-спектрометрия— метод исследованиявещества, основанный на определении отношения массы  к заряду ионов, образующихся прионизациипредставляющих интерес компонентов пробы. Один из мощнейших способов качественной идентификации веществ, допускающий также и количественное определение.
  С помощью масс-спектрометрии можно анализировать высокомолекулярные соединения с массой до нескольких 1 млн. Да (белки, полипептиды, синтетические полимеры и пр.).
  Области применения масс-спектрометрии:
  1. Установление строения соединений.
  2. Элементный анализ неорганических веществ (одновременно определяются до 70 элементов).
  3. Определение возраста геологических пород по анализу содержания изотопов химических элементов.
  4. Хромато-масс-спектральный анализ в экологии.
  5. Изучение элементарных химических процессов: ионизации, перегруппировок, ионных реакций.
  6. Определение термодинамических величин: потенциалов ионизации, энергии диссоциации молекул.
  Масс-спектрометрия – совокупность трёх отдельных процессов:
  1. Ионизация молекулы.
  2. Разделение ионов по массам.
  3. Детектирование ионов.
  Типы ионов в масс-спектрах
  1. Молекулярный ион – молекула с положительным зарядом (катион-радикал), полученным за счёт отрыва одного электрона от нейтральной молекулы.
  2. Основной ион – ион, интенсивность которого в масс-спектре максимальна.
  3. Фрагментный ион – ион, образующийся при распаде молекулярного иона с разрывом связей и миграцией атомов.
  Система MALDI BioTyper  позволяет получить результат в течение нескольких минут, в отличие от традиционно используемых «классических» методов, масс-спектрометриятребует минимальных трудовых и финансовых затрат на подготовку и анализ образцов.

Готовая база данных микроорганизмов и простое в использовании аналитическое программное обеспечение позволяют осуществлять четкую идентификацию тысяч видов бактерий и дрожжевых грибов.
MALDI Biotyper– революционная разработка в области микробиологии компании Bruker. Система за несколько секунд оценивает наличие уникального набора белков неизвестного микроорганизма.
Идентификация микроорганизма с помощью MALDI Biotyper – современный, быстрый и рентабельный метод, реализованный на базе масс-спектрометров   Microflex. Любая микробиологическая лаборатория оценит возможность прямой идентификации колонии микроорганизма уже после первичного посева, быструю и простую пробоподготовку, возможность работы с положительными гемокультурами, мочой, ликвором и другими жидкими средами, содержащих достаточное количество микроорганизмов.
Идентификация одного образца занимает менее минуты и производится в автоматическом режиме.
MALDI Biotyper подразумевает использование минимального количества расходных материалов и пластика.  Результат идентификации возможно напрямую отправить по почте или на принтер.

По данным многочисленных сравнительных исследований результаты идентификации Biotyper на 15-25% точнее результатов бактериологических анализаторов. Поскольку маркерами, по которым идентифицируются микроорганизмы, являются белки, то результат не зависит от способа культивации и не связан с ростом микроорганизмов.

Идентификация и видовое типирование микроорганизмов.

Microflexэффективно работают с различными типами анализируемых образцов:

• питательными средами,
• биологическими образцами,
• гемокультурами.

Осуществляемые идентификация и видовое типирование дают возможность выявить бактерии, дрожжи и грибы, а также оценить иммунную реакцию организма на их присутствие. В области клинической диагностики эта задача является одной из наиболее сложных.

Для анализа используется уникальная современная методика MALDI-Biotyper . Она обладает гораздо более высокой достоверностью по сравнению с другими способами диагностики.
К примеру, такой подход позволяет различить несколько десятков видов распространенных грибов Candida. В процессе измерений выводится спектр константных белков неизвестных микроорганизмов, в дальнейшем сравниваемый с базой данных.
Эти сведения необходимы для определения родовой и видовой принадлежности бактерий.

Определение чувствительности к антибиотикам.

Помимо идентификации и типирования микроорганизмов, масс-спектрометры позволяют определить их чувствительность к антибиотикам. С помощью этого прибора специалисты могут регистрировать изменения в реакции среды на то или иное вещество. Такая технология дает возможность выявить ряд наиболее эффективных препаратов для лечения конкретных видов бактерий.
MALDI Biotyper — система имеет огромное практическое значение. В том числе, спектрометрия может стать эффективным инструментом сокращения числа заболеваний, передающихся половым путем.
Сегодня масс-спектрометрия активно применяется в медицине для идентификации и определения чувствительности к антибиотикам возбудителей хеликобактериоза.
Бактерия Helicobacter является основной причиной развития заболеваний желудочно-кишечного тракта: язв, рака.
Использование технологии MALDI- Biotyper   в перспективе поможет значительно продвинуться в лечении этих болезней.[15]

Создание генетического паспорта и его значение.
Благодаря масс-спектрометрии по системе MALDI- Biotyper сегодня возможно создание генетического паспорта человека. Он имеет огромное значение как в практическом, так и и научном отношении.
Генетический паспорт представляет собой индивидуальную генетическую карту. Прибор позволяет выявить олигонуклеотидные полиморфизмы.
Эти клетки являются точечными заменами нуклеотидов в составе ДНК человека. По наличию таких наследуемых генетических аллелей можно судить о величине риска развития заболеваний под действием различных факторов.
Материалом для составления генетического паспорта является венозная кровь пациента. В качестве объекта исследования используется выделенная из нее ДНК. Процедура осуществляется в несколько этапов:[13]

• ПЦР-амплификация ДНК,
• инактивация дезокситрифосфатов, очистка продуктов реакции,
• минисеквенирование, терминирование синтеза мононуклеотидных полиморфизмов,
• очистка полученных продуктов,,
• исследование,
• анализ результатов.

На выходе специалисты получают для оценки масс-спектры продуктов минисеквенирования, по пикам которых можно судить о нуклеотидном контексте. Составленный на основе этих данных генетический паспорт позволит с высокой вероятностью прогнозировать развитие наследуемых патологий. В области терапии это открывает большие возможности для профилактики, торможения и купирования заболеваний. В научном смысле методика массспектрального анализа является значительным прогрессом в развитии медицины и микробиологии в частности.

Работа с MALDI Biotyper:

-MALDI Biotyper адаптирован для пользователей не имеющих опыта масс-спектометрии;
- Для анализа требуется единичная колония или небольшая аликвота жидкой среды;
- Необходимо выполнить несколько простых шагов;
- Програмное обеспечения автоматизирует процесс накопления и анализа результатов;
- По итогам работы система генерирует подробный отчет с результатами идентификации;
- Вся процедура занимает всего несколько минут.
При необходимости возможно проведение дополнительных процедур экстракции белков,позволяющих анализировать позитивные гемокультуры,а также традиционно сложные для обычного бактериологического анализа микробактерии и грибы.

2.4. Принцип работы на Miсflex:

Рисунок 10.Micrflex.

1.Единичные колонии снимают с поверхности агара и вносят в планшет для масс-спектрометрии [11.]

Рисунок 11.Колонии микроорганизмов.

2.Подсушивают на воздухе 3 минуты до визуального высыхания.[12]
3.Наслаивают насыщенный раствор матрицы и подсушивают еще 5мин
4. Ставят планшет в прибор[10]

Рисунок 12.Планшет .

5. Для получения каждого масс-спектра используют импульс лазера для ионизации образца .

6. На экране появляются спектр. [13]

Рисунок 13 Спектр.

7. Спектры сравнивают с библиотекой (прибор сравнивает самостоятельно )
8. Далее результат смотрит специалист.
Расходные материалы:
Одним из ключевых преимуществ системы MALDI Biotyper является небольшое количество и дешевизна расходных материалов, необходимых в повседневной рутинной практике.
Для прямой идентификации используется:

• Одноразовая пластиковая  бактериологическая петляобъемом 1 мкл для забора колонии с чашки и нанесения ее на стальную мишень (чип).
• Заранее приготовленный раствор матрицы, наносимый в объеме 1-2 мкл с использованием дозатора и соответствующего наконечника.
• И калибровочный стандарт, представляющий собой белки E.Coli, наносимый также в объеме 1-2 мкл на одну из 96 позиций мишени (чипа).

Дополнительные расходные материалы для MALDI Biotyper необходимы в двух основных случаях:

• Приготовление раствора матрицы и калибровочного стандарта
• Проведение процедуры дополнительной экстракции белков микроорганизмов для повышения точности идентификации
  Прибор Микрофлекс получил широкое применение в медицине.
  Его используют для:
•  Идентификации микроорганизмов по масс-спектру рибосомальных белков;
• Белкового  профилирования сывороточных и тканевых биомаркеров
•  Для определения антибиотикорезистентности
•  Для выявления генетических рисков  развития заболеваний человека

Этот прибор максимально прост в использовании.

• Он адаптирован для пользователей не имеющих опыта масс-спектометрии;
• Для анализа требуется единичная колония или небольшая аликвота жидкой среды;
• Програмное обеспечения автоматизирует процесс накопления и анализа результатов;
• По итогам работы система генерирует подробный отчет с результатами идентификации;
• Вся процедура занимает всего несколько минут.

Сравнительная характеристика классических методов диагностики микроорганизмов  и метода  идентификации бактерий при помощи масс-спектрометрии.

Сравнительная характеристика эффективность использования масс-спектрометра с системой MALDI Biotyper и автоматического бак.анализатора

Условия культивирования  существенного влияния на процедуру прямого бактериального профилирования не оказывают.

Можно использовать как различные среды, так и различные условия роста, рекомендуемые для конкретных групп патогенов. Все эти условия мало влияют на набор пиков, представленных на масс-спектре. Практически все пики воспроизводимы.

Тем не менее, для получения максимально воспроизводимых результатов лучше анализировать культуру в поздней фазе роста.

Использовать нужно только свежий материал, выросший за одну ночь, или, в случае медленно растущих бактерий, выросших за несколько дней. Допускается   хранение  чашек при комнатной температуре (+22-+25С) в течение нескольких дней. При хранении культивационных чашек при +4С качество полученных масс-спектров снижается довольно быстро.

Возможны измерения жидкой культуры и лиофилизированных клеток . В случае жидкой культуры необходимо получить осадок клеток микроорганизма центрифугированием и подвергнуть его стандартной процедуре анализа.

Кроме того, метод обеспечивает успешную идентификацию для традиционно сложных в микробиологии объектов, таких как микобактерии и мицелиальные грибы.

Так же, системы масс-спектрального анализа  позволяют производить диагностику смеси двух микроорганизмов, что имеет высокое клиническое значение.

Заключение:

В результате проделанных исследований были:
1. изучены  данные о принципах работы  масс-спектрометра Microflex;
2. выделен спектр возможных исследований;
3. самостоятельно освоен алгоритм работы на приборе;
4. проведена сравнительная характеристика ''классических'' методов диагностики бактерий и  метода масс-спектрометрии.
5. проведена сравнительная характеристика  диагностики с помощью прибора Bactec и  метода масс-спектрометрии.

Вывод:

Метод масс-спектрального анализа в диагностике микроорганизмов – это революционная разработка в области бактериологии, которая  за несколько секунд оценивает наличие уникального набора белков неизвестного микроба и позволят определить  его  род и вид в течение нескольких минут
Масс-спектральный анализ в микробиологической диагностике-это возможность быстрой безошибочной идентификации патогенных бактерий,что необходимо для успешного лечения  инфекционных заболеваний
Практическая значимость:

Результаты проведенных исследований будут полезны для медицинских работников бактериологических лабораторий в качестве справочных материалов и для студентов медицинских образовательных учреждений как учебная информация.

Список использованной литературы

1. Перечень исследований, проводимых в бактериологической лаборатории/Режим доступа к изд https://ru.wikipedia.org/wiki/

2. История микробиологии / Режим доступа к изд http://collegemicrob.narod.ru/microbilogy/
3. . История микробиологической лаборатории/ Режим доступа к изд: http://microbiologu.ru/ mikroorganizmyi/mikrobiologiya-i-ee-razvitie/istoriya-razvitiya-mikrobio.html

4. Приказ Министерства здравоохранения об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений № 535 от 22.04.1985
5. Приказ Министерства Здравоохранения и медецинской промышленности  Российской Федерации  о развитии и совершенствовании деятельности лабораторий клинической микробиологии (бактериологии) лечебно-практических учреждений № 8 от 19 января 1995 г.

6 Лабинская А.С. Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология / А.С.Лабинская, Е.Г.Волина., Бином,2008.–1077с.

7.Черкесб Ф.К. Учебник по микробиологии / Ф.К.Черкес, Л.Б.Боявленская, Н.А.Бельская.,2009. – 511 с.
8. Лабинская А.С. Общая и санитарная микробиология / Е.Г Волина. 2008-1077.

9. Краткая инструкция для автоматического бактериологического анализатора BacT ALERT 3D./ 2013-54.
10. Инструкция для автоматического  батериологического  анализатора Micrflex.

.Библиографическое описание электронного издания:
Материал из Википедии о бактериологической лаборатории / Режим доступа к изд.:  https://ru.wikipedia.org/wiki/Бактериологическая_лаборатория
11.«medical-enc ».Помещение в бактериологичесой лаборатории. Режим доступа к изд.:http://www.medical-enc.ru/2/bacteriological_laboratory.shtm 

12. Алексаандр Полтавский .Современный взгляд на микробиологическую лабораторию,2013-4с.
3.Перечень исследований, проводимых в бактериологической лаборатории/ Режим доступа к изд.:http://www.mosderm.ru/kontakty/adresa-filialov/filial-veshnjakovskij/bakteriologicheskaja-laboratorij
14.Приказ Минздрава СССР от 22 апреля 1985 г. N 535 "Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений"

15. История развития масс-спектрометрии/Режим доступа к изд:

http://www.sciteclibrary.ru/texsts/rus/analit/an2806.htm
16. Масс-спектральный анализ. Режим доступа к изд: http://allbest.ru/o-2c0a65625b2ac78a4d53b88521306d27.html