ПРАКТИКУМ ПО БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ. Часть 1

Министерство сельского хозяйства и продовольствия

Департамент кадровой политики

Волгоградская государственная сельскохозяйственная академия

кафедра химии

ПРАКТИКУМ ПО БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ. Часть 1

Методическое пособие для зооветеринарного факультета

Для студентов специальности 310800 «Зоотехния» и 310700 «Ветеринария».

Волгоград 2002

Храмов В.А., Комарова В.И., Спивак М.Е. Практикум по биологической химии (часть 1). Методическое пособие для зооветеринарного факультета. — Волгоград, 2002. — 24 с.

        В настоящем пособии представлен комплекс лабораторных работ по биохимии углеводов, липидов, белков. Практикум составлен с учетом специальности «зооинженер» и «ветеринар», но может быть полезен и для студентов других биологических специальностей. Большинство лабораторных работ носит качественный характер, но может быть легко трансформировано в количественные методики с использованием подходящего фотоэлектроколориметра. Многие работы, особенно из раздела «Белки», являются результатом разработок кафедры химии ВГСХА и не представлены в общепринятых практикумах для студентов сельхозвузов. Пособие снабжено списком задач по биохимии для самостоятельной работы студентов зооветфакультета.

Предлагаемое пособие включает лабораторные работы по первым разделам курса биохимии, а именно по химии углеводов, липидов, белков. В связи с ограниченной доступностью материала для анализа широко используются смывы с кожи человека и лабораторных животных, слюна, образцы кормов. С учетом наглядности подобраны методики, приводящие к образованию окрашенных продуктов. С помощью лабораторного фотоэлектроколориметра такие цветные реакции всегда можно перевести в количественный вариант.

        Химия углеводов

        Углеводами называют полиоксиальдегиды и полиоксикетоны, а также полимеры этих соединений. В биосфере углеводов больше, чем всех других органических соединений, вместе взятых. В расчёте на сухое вещество растения содержат 80-90%, животные организмы – 2% углеводов от массы тела. Углеводы являются конечными продуктами реакции фотосинтеза у растений. Животные, не обладая способностью к подобной аккумуляции солнечной энергии, используют вещества, накапливающиеся в растениях.

        Классификация углеводов

        I Моносахариды (не способны гидролизоваться без потери углеводных свойств)

        II Олигосахариды гидролизуются с образованием небольшого числа моносахаридов (от 2 до 10)

        III Полисахариды при гидролизе образуют большое число моносахаридов (десятки и сотни)

        Моносахариды. По содержанию альдегидной или кетонной группы моносахариды делят на альдозы и кетозы. По числу углеродных атомов различают триозы (три атома углерода), тетрозы (четыре атома углерода), пентозы, гексозы, гептозы и т.д. Всем моносахаридам присуща стереоизомерия. В живых организмах преобладают D- формы углеводов. Исключения: L- арабиноза, L- моносахариды у бактерий. 

        Триозы в свободном виде в организме практически не встречаются. Фосфорные эфиры триоз (3- фосфоглицериновый альдегид и диоксиацетонфосфат) являются промежуточными веществами в обмене углеводов. 

        Пентозы: β- D- рибоза входит в состав нуклеотидов. Нуклеотиды – компоненты РНК, АТФ и некоторых ферментов. 2- дезокси –D- рибоза – составная часть ДНК. D- ксилоза входит в состав полисахаридов клеточных стенок растений.

        Гексозы.  Альдогексозы: α – D- глюкопираноза (α-глюкоза) входит в состав крахмала, сахарозы. В свободном виде присутствует во фруктовых соках (виноградный сахар), в плазме крови человека и животных. (β- глюкоза) входит в состав целлюлозы. β – D- галактопираноза составная часть молочного сахара (лактозы).

        Кетогексоза  β – D- фруктофураноза в свободной форме содержится о фруктовых соках и мёде, в связанной форме в сахарозе и полисахаридах (например, в инулине).

        Производные моносахаридов

        1) фосфорные эфиры являются промежуточными веществами в обмене углеводов.

        2) уроновые кислоты. Глюкуроновая кислота входит в состав полисахаридов, участвует в обезвреживании токсичных продуктов обмена белков в печени. Галактуроновая кислота служит структурным блоком некоторых полисахаридов.

        3) аминосахара входят в состав полисахаридов и гликопротеинов.

        Дисахариды. При образовании гликозидной связи между полуацетальным гидроксилом одного моносахарида и ОН- группой другого моносахарида получается дисахарид. Если у второго моносахарида  в образовании связи участвует спиртовой гидроксил, а полуацетальный гидроксил остаётся свободным, дисахарид будет восстанавливающим (есть возможность для раскрытия цикла и образования альдегидной группы, обладающей восстанавливающими свойствами; такой дисахарид будет восстанавливать реактив Фелинга, серебро из оксида и т.п.)

        Мальтоза, α – D- глюкопиранозил-(1→4) – D- глюкопираноза. Образуется при гидролизе крахмала под действием амилаз солода. Восстанавливающий дисахарид.

        Целлобиоза, β– D- глюкопиранозил — (1→4) — D- глюкопираноза. Промежуточный продукт при гидролизе клетчатки в рубце жвачных под действием ферментов микрофлоры рубца. Восстанавливающий дисахарид.

        Лактоза, β– D- галактопиранозил — (1→4) — D- глюкопираноза – углеводный компонент молока млекопитающих. В коровьем молоке содержится до 4,5% лактозы, в женском молоке – до 7,5%. Это восстанавливающий дисахарид.

        Сахароза, α– D- глюкопиранозил — (1→2) — β– D- фруктофуранозид, относится к невосстанавливающим дисахаридам. Служит растворимым резервным сахаридом и транспортной формой, которая легко переносится по растению. Высоко содержание сахарозы в сахарной свекле и сахарном тростнике. Мёд образуется при ферментативном гидролизе цветочного нектара в пищеварительном тракте пчелы и содержит инвертный сахар — равные количества глюкозы и фруктозы.

        Полисахариды. Гомополисахариды (гомогликаны) – полисахариды, построенные из моносахаридных звеньев одного типа.

        Крахмал — резервный полисахарид растений. Для человека и животных является важным углеводным компонентом пищевого рациона. Крахмал состоит из двух фракций: амилозы (рис. 1) и амилопектина. В зависимости от вида растения на амилозу приходится 10-30 %, на амилопектин 70-90%.

        Гликоген — резервный полисахарид животных. По строению аналогичен амилопектину крахмала, но если у амилопектина точки ветвления располагаются через 20-25 остатков глюкозы, то у гликогена — через 8-10.

        Клетчатка (целлюлоза) у жвачных животных расщепляется в рубце под действием ферментов микрофлоры до глюкозы и далее — ЛЖК (летучих жирных кислот). У моногастричных животных не расщепляется, но улучшает перистальтику кишечника. Состоит из остатков β- глюкозы.

        Хитин — полисахарид, формирующий наружный скелет насекомых и панцирей ракообразных; состоит главным образом из N-ацетилглюкозамина (рис. 1).

        Гетерополисахариды (гетерогликаны) при гидролизе образуют смесь различных производных моносахаридов — уроновые кислоты и аминосахара). Большинство полисахаридов этой группы в различной степени эсетрифицировано остатками серной кислоты, которые усиливают их кислотные свойства. Присутствуют в организме как в свободном виде, так и в составе протеогликанов и гликопротеинов. Основные представители гетерополисахаридов — гиалуроновая кислота, гепарин, хондроитинсульфаты, кератансульфаты.

        Гиалуроновая кислота является высокомолекулярным веществом. Входит в состав основного вещества соединительной ткани. Обнаруживается в стекловидном теле глаза, пупочном канатике, синовиальной жидкости суставов. Гиалуроновая кислота построена из дисахаридных звеньев, состоящих из N-ацетилглюкозамина и глюкуроновой кислоты, соединенных в положении β (1—3) связью (рис.1). Повторяющиеся звенья связаны в положении β (1—4). За счет гидратации карбоксильных и спиртовых групп гиалуроновая кислота при образовании гелей связывает 10 000 кратный объём воды.

        Лабораторные работы

        Работа 1. Определение глюкозы в смывах с кожи человека глюкозооксидазным методом.

        Глюкозооксидазный метод широко применяется для количественного определения глюкозы в крови. Он основан на двух ферментативных реакциях: 1) образование Н2О2 при окислении глюкозы под действием фермента глюкозооксидазы:

        С6Н12О6 + О2 + Н2О → С6Н12О7 + Н2О2

Рис.1

        2) разложение Н2О2 пероксидазой с образованием атомарного кислорода, который реагирует с хромогеном (пирогаллол), превращая его в окрашенное соединение:

        2 Н2О2 + пирогаллол бесцветный → 2 Н2О + пурпурогалин красный

        На ладонную поверхность нанести 1-2 мл готового ферментно-хромогенного реактива «Глюкоза-ФКД». Через 2 мин реактив слить в пробирку и оставить стоять полчаса при комнатной температуре. За это время при наличии глюкозы в смыве развивается красное окрашивание. Аналогичным образом можно обнаружить глюкозу в смывах с кожи и шерсти животных.

        При необходимости можно выполнить количественное определение, используя фотоэлектроколориметр и пробу со стандартным раствором глюкозы. Метод весьма специфичен, реакция происходит только с глюкозой.

        Работа 2. Различие между лактозой и сахарозой.

        Различие в характере связи между гликозидными остатками в сахарозе и лактозе позволяет отличить одну от другой. Лактоза обладает восстанавливающими свойствами, а сахароза нет.

        В одну пробирку налить 1 мл 1%-ного раствора сахарозы, в другую раствор лактозы. В обе пробирки добавить по 0,1 – 0,2 мл 1%-ного раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл 10%-ной щелочи. Кипятить обе пробирки на водяной бане несколько минут. В пробирке с лактозой – ярко-оранжевое окрашивание, в пробирке с сахарозой – без изменений. Аналогичную реакцию проделать с молочной сывороткой, возникающее оранжевое окрашивание свидетельствует о наличии восстанавливающих сахаров в молоке (глюкоза, лактоза).

        Работа 3. Реакция крахмала с йодом. Ферментативный гидролиз крахмала.

        Характерная реакция на крахмал – появление синего окрашивания при добавлении раствора йода в йодиде калия. В результате реакции образуется клатратное соединение. Окраска раствора зависит от строения полисахарида. Амилоза даёт синее окрашивание, амилопектин и гликоген – красновато-коричневое. Благодаря непрочности адсорбционного комплекса йода с крахмалом эта реакция чувствительна к присутствию спирта, нагреванию и действию щелочей.

        В пробирку налить 3 мл 1%-ного раствора, содержащего крахмал (вытяжка из картофеля, муки и т.п.), прилить 1 каплю раствора Люголя. Появляется синее окрашивание. Содержимое пробирки разделить на три части. К первой добавить 2 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия, ко второй – 3 мл этанола, третью нагреть. Наблюдать исчезновение окраски во всех случаях. В третьей пробе при охлаждении вновь появляется окрашивание.

        При действии амилолитических ферментов крахмал расщепляется до глюкозы и мальтозы:

К 1 г пшеничной муки добавить 10 мл воды, прокипятить, дать отстояться и декантировать надосадочную жидкость. В две пробирки поместить по 1 мл полученного раствора. В первую пробирку добавить 1 каплю раствора Люголя, наблюдать появление характерного окрашивания. Во вторую пробирку добавить 0,5 мл слюны и оставить на 10-15 минут при комнатной температуре. Затем в неё добавить 1 каплю раствора йода. Отсутствие синего окрашивания с йодом говорит о гидролизе крахмала под действием амилазы слюны.

        В этих же пробирках выполнить реакцию Троммера: добавить 1 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия, 0,2 мл 5%-ного раствора сульфата меди. Нагреть. Реакция Троммера положительна только во второй пробирке.

        Работа 4. Разделение и идентификация углеводов с помощью бумажной хроматографии.

        Для разделения углеводов можно применять смесь изопропанол - вода (4:1). Смесь для разделения налить на дно сосуда. На полоску хроматографической бумаги нанести растворы углеводов и исследуемые растворы на расстоянии не менее 1 см друг от друга. Нижний край полоски поместить в растворитель, который, поднимаясь, разделяет смесь углеводов. Отметить границу подъёма растворителя, высушить полоску. Затем хроматограмму осторожно смочить проявителем; используется щелочной раствор перманганата калия (1%-ный водный раствор перманганата калия, содержащий 2%-ный раствор карбоната натрия). Высушить над плиткой. Углеводы дают жёлтые пятна на пурпурном фоне, а затем серые пятна на коричневом фоне. Затем измерить расстояние от центра пятна до стартовой линии (АВ) и от линии фронта растворителя до стартовой линии (АС). Относительную подвижность вещества характеризует величина R f = AB/AC

        Химия липидов

        Липиды – органические вещества, которые плохо растворимы в воде, но растворяются в органических растворителях (бензин, хлороформ, эфир и т.п.). Липиды делят на омыляемые (содержащие эфирные связи) и неомыляемые в зависимости от способности к гидролизу с образованием в щелочной среде мыл, т.е. солей высших карбоновых кислот.

        Жирные кислоты служат строительными блоками для большинства липидов. Они являются монокарбоновыми кислотами с неразветвленной углеродной цепью, как правило, с чётным числом атомов углерода. В настоящее время из живых организмов выделено свыше 70 жирных кислот. Их можно разделить на две большие группы – ненасыщенные и насыщенные. В типичных липидах животного происхождения преобладающей насыщенной жирной кислотой является пальмитиновая (С16), второе место занимает стеариновая (С18) [табл. 1]. Ненасыщенные жирные кислоты содержат одну (олеиновая) или несколько двойных связей, имеющих цис- конфигурацию. Особо следует подчеркнуть роль линолевой (2 —С==С—) и линоленовой (3 —С==С—) кислот как соединений, незаменимых для человека (витамин F). В организме они не могут быть синтезированы и должны поступать с пищей в количестве около 5 г в день. Эти кислоты содержатся в основном в растительных маслах [табл. 1]. Важную роль играет также арахидоновая кислота
(С 19Н 31СООН) как предшественник простагландинов.

        Таблица 1

        Жирнокислотный состав и свойства природных жиров

        Простагландины – продукты окисления жирных кислот С20, имеющие в своём составе циклопентановое кольцо. У человека все клетки и ткани, за исключением эритроцитов, синтезируют простагландины разных групп.

        Среди омыляемых  липидов различают простые и сложные. Простые получили свое название вследствие того, что они состоят только из атомов С, Н и О. К ним относятся две группы соединений: нейтральные жиры и воски.

        Нейтральные жиры включают в себя сложные эфиры глицерина и жирных кислот. В организме играют роль структурного компонента клеток или запасного вещества («жировое депо»). В природе, за редкими исключениями, встречаются только полные эфиры глицерина – триацилглицерины (ТАГ). Твердые ТАГ называют жирами, жидкие — маслами. Простые ТАГ содержат остатки одинаковых кислот (тристеарин, триолиен), смешанные – различных (олеопальмитобутирин – жир коровьего молока).

        Природные жиры и масла представляют собой смеси смешанных ТАГ. Их количественной характеристикой служит %-ное содержание отдельных кислот, а также аналитические константы—кислотное число, йодное число, число омыления, эфирное число (жировые числа).

        кислотное число — количество мг КОН, необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот в 1 г жира. Увеличение к.ч. при хранении свидетельствует о происходящем в жире гидролизе, т.е. порче жира.

        йодное число – количество г йода, связываемое 100 г данного жира. Мера ненасыщенности [табл. 1].

        От жирно-кислотного состава зависит ещё одна характеристика жира – температура плавления [табл. 1].

        При хранении жиры под действием света, кислорода и влаги приобретают неприятный вкус и запах – прогоркают. Во избежание этого добавляют антиоксиданты. Наиболее важный среди них – витамин Е (тоже относится к липидам).

        Воски – сложные эфиры жирных кислот и высших одноатомных или двухатомных спиртов. Число углеродных атомов у таких спиртов составляет от 16 до 22: цетиловый спирт (С16Н33ОН), мирициловый спирт (С31Н63ОН). Природные воски синтезируются живыми организмами и содержат до 50% примесей свободных жирных кислот, красящих и душистых веществ. В воде воски нерастворимы, t˚ плавления лежат в интервале 40˚—90˚ С.

        Воски выполняют в организме в основном защитную функцию. Они образуют защитную смазку на коже, шерсти, перьях; покрывают листья, стебли, плоды, семена, а также кутикулу наружного скелета у многих насекомых. Восковой налёт предохраняет от смачивания, высыхания и проникновения микробов. Удаление воскового слоя с поверхности плодов приводит к более быстрой их порче при хранении. Воски также являются главным липидным компонентом многих видов морского планктона. Широкое применение находил ранее содержащийся в черепной полости кашалота спермацет – как основа кремов и мазей. Его главные компоненты – цетилпальмитат и мирицилпальмитат. В настоящее время аналоги спермацета синтезированы искусственно. Овечью шерсть покрывает ланолин, использующийся в косметике. Пчелиный воск сочетает пластичность с кислотоустойчивостью, электро- и водоизоляционными свойствами. В отличие от нейтральных жиров воски более устойчивы к действию света и окислителей.

        В класс сложных липидов входят три группы соединений: фосфолипиды, гликолипиды, сульфолипиды. Молекула фосфолипидов образована остатками глицерина (или заменяющего его спирта сфингозина), жирных кислот, фосфорной кислотой, которая соединена сложноэфирной связью с азотсодержащей полярной группировкой. Фосфолипиды широко распространены в растительных и животных тканях,  микроорганизмах они являются преобладающей формой липидов. В отличие от нейтральных жиров фосфолипиды практически содержатся только в клеточных мембранах  очень редко в небольших количествах обнаруживаются в составе запасных отложений. Особенно велико их содержание в нервной ткани человека и позвоночных животных.

        Общая формула глицерофосфолипидов выглядит так:

        Простейшим глицерофосфолипидом является фосфатидная кислота (R3=H). В тканях организма она содержится в незначительных количествах, но является важным промежуточным соединением в синтезе ТАГ и фосфолипидов.

        Наиболее представлены в клетках различных тканей фосфатидилхолин (лецитин) и фосфатидилэтаноламин (кефалин). У них роль R3 выполняют аминоспирты: холин НО—СН2—СН2—N+ ≡ (СН3) и этаноламин НО—СН2—СН2—NН2. Эти два глицерофосфолипида метаболически тесно связаны друг с другом. Они являются компонентами большинства биологических мембран.

        В тканях находятся и другие глицерофосфолипиды. В фосфатидилсерине R3= аминокислоте серину. В фосфатидилинозите фосфорная кислота этерифицирована шестиатомным спиртом инозитом. Фосфатидилинозиты представляют интерес как возможные предшественники простагландинов.

        Сфинголипиды содержат те же компоненты, что и глицерофосфолипиды (жирная кислота, фосфат, R3 – заместитель), но вместо глицерина они включают аминоспирт сфингозин:

        Широко распространенный представитель этой группы – сфингомиелин. Особенно богата им нервная ткань, в частности, мозг.

        Характерной особенностью фосфолипидов является их бифильность. В фосфатидилхолинах, например, радикалы жирных кислот образуют два неполярных «хвоста», а фосфатная и холиновая группа – полярную «голову».

        На границе раздела фаз такие соединения действуют как детергенты или ПАВ. О наличии фосфолипидов в биологических объектах можно судить по содержанию фосфора (реакция с молибденатом аммония) после минерализации образца.

        Не содержат фосфорную кислоту гликолипиды они широко представлены в миелиновых оболочках нервов. В состав гликолипидов животных входит сфингозин, жирная кислота и углеводный остаток (чаще D-галактоза):

Ганглиозиды имеют более сложное строение:

        Ганглиозиды обнаруживаются обычно на внешней поверхности клеточных мембран, особенно в нервных клетках. Они выполняют рецепторные функции. Отмечено распределение цереброзидов и ганглиозидов в тканях мозга: в составе белого вещества преобладают цереброзиды, в составе серого ганглиозиды.

        Сульфолипиды (сульфатиды) имеют структуру, аналогичную цереброзидам, с той лишь разницей, что у третьего атома углерода галактозы вместо гидроксильной группы – остаток серной кислоты. Сульфатиды обнаружены в миелине.

        Неомыляемые липиды так названы потому, что они не подвергаются гидролизу. Известны два типа неомыляемых липидов.

        Высшие спирты (холестерин, витамины А, D, E). Холестерин — производное циклопентанпергидрофенантрена (стерана). В кристаллическом виде — белое, оптически активное вещество, практически нерастворимое в воде. Главный компонент мембран, исходное соединение для синтеза стероидных гормонов, желчных кислот, витамина D3. В растениях обнаружены фитостерины.

        Высшие углеводороды (терпены). Молекулы построены путем объединения нескольких молекул изопрена. Придают растениям свойственный аромат, служат главными компонентами душистых масел. К терпенам принадлежат каротиноиды и каучук.

        Лабораторные работы

        Работа 1. Качественное исследование жира.

        1) Исследовать растворимость говяжьего сала и растительного масла в различных растворителях и различных условиях. Результаты оформить в виде таблицы:

К 2-3 мл растворителя добавить немного жира или масла, энергично встряхнуть. Отметить в таблице растворимость  «+». Сделать вывод о растворимости жиров в неполярных растворителях.

        2) Обнаружение глицерина (акролеиновая проба).

        В пробирку внести 2-3 капли масла (жира), прибавить кристаллический гидросульфит натрия. Нагреть (под тягой!) до появления белых густых паров. Отметить раздражающий запах акролеина. Подержать у отверстия пробирки бумагу, смоченную фуксинсернистой кислотой. Отметить появление ярко-розового пятна. Повторить опыт, взяв кусочек воска. Сделать вывод о присутствии глицерина в жирах и восках.

        3) Эмульгирование жиров

        Поместить в 6 пробирок по 3-4 капли исследуемого растительного жира и по 2-3 мл дистиллированной воды. Добавить в первую пробирку несколько капель раствора белка, во вторую — несколько капель раствора гидроксида калия, в третью — несколько капель раствора соды, в четвертую — несколько капель раствора мыла, в пятую — несколько капель желчи. Шестая пробирка будет служить контролем. Взболтать содержимое всех пробирок, поставить их по порядку в штатив. Наблюдать образование в первых пяти пробирках относительно устойчивой эмульсии, а в шестой пробирке (контроль) – расслоение неустойчивой эмульсии на жир и воду.

        Работа 2. Обнаружение лецитина.

        Поместить в стаканчик 1/5 часть куриного желтка. Добавить при помешивании15 мл горячего спирта. Отфильтровать. В сухую пробирку налить 2-3 мл ацетона и к нему по каплям прилить полученный фильтрат. Наблюдать появление мути в ацетоне, что указывает на выпадения лецитина, который в ацетоне нерастворим.

        Работа 3. Качественная реакция на лецитин.

        К 2-3 мл спиртового раствора лецитина из предыдущего опыта добавить 1 мл насыщенного спиртового раствора хлорида кадмия. Выпадает белый хлопьевидный осадок комплексного соединения лецитина. Эту реакцию раствор холестерина не даёт.

        Работа 4. Качественные реакции на холестерин

        1) Реакция Сальковского

        В сухую пробирку налить 1 мл раствора холестерина в хлороформе, добавить 1 мл конц. Серной кислоты. Встряхнуть (осторожно!). Слой хлороформа окрашивается в кроваво-красный цвет, слой серной кислоты – в красный цвет с зеленой флуоресценцией.

        2) Реакция Либермана-Бурхарда

        В пробирку налить 1-2 мл раствора холестерина в хлороформе, добавить 10 капель уксусного ангидрида и 2 капли конц серной кислоты. Хорошо взболтать. Наблюдать образование красной окраски, её переход в фиолетовую, затем в синюю и зеленую.

        Под действием концентрированной серной кислоты происходит дегидратация. В результате две молекулы холестерина соединяются между собой по третьему атому углерода с образованием окрашенного продукта. Эта реакция используется для количественного определения холестерина в крови и других объектах.

        Работа 5. Обнаружение холестерина в сливочном масле и маргарине.

        В пробирку налить 1-2 мл раствора сливочного масла (или маргарина) в хлороформе, добавить 10 капель уксусного ангидрида и 2 капли конц серной кислоты. Хорошо взболтать. Сравнить содержание холестерина в сливочном масле и маргарине.

        Работа 6. Экстракция каротина из моркови.

        Небольшую порцию стружки моркови залить 1-2 мл бензола. Наблюдать оранжевое окрашивание надосадочной жидкости. Другую такую же порцию залить водой. Цвет воды не изменяется.

        Химия протеинов

        Белки (протеины) составляют основную часть органического материала тела животного.

        Табл. 2

        Содержание белков в тканях животных (в % от сухой ткани)

По химической природе белки представляют собой биополимеры, состоящие из аминокислот, последние связаны друг с другом с помощью пептидной связи —CО—NH—. Размер белковых молекул достаточно велик и находится в пределах 10 –5 – 10 –7см, что соответствует размеру коллоидных частиц. Поэтому растворы белков проявляют типичные свойства коллоидных растворов (золей), а именно: они не проходят через полупроницаемые мембраны, образуют конус Тиндаля при боковом освещении, опалесцируют. В отличие от типичных золей растворы белков достаточно устойчивы, однако при воздействии минеральных и органических кислот, солей (особенно тяжелых металлов), некоторых органических растворителей (спирт, ацетон) они подвергаются коагуляции. Классическим примером коагуляции белков является створаживание молока.

        Лабораторные работы

        Работа 1. Приготовление белкового раствора и его коагуляция.

        Примерно 1 г пшеничной муки залить 10 мл воды, тщательно перемешать  и дать отстоятся (15—20 минут), отфильтровать вытяжку муки. Наблюдать опалесценцию фильтрата. Фильтрат разделить на 5 равных частей и к каждой добавить по несколько капель а) 1-2% раствора серной кислоты; б) 10% раствора трихлоруксусной кислоты; в) 5% раствора сульфата меди. Везде наблюдаем усиливающееся помутнение раствора белка (коагуляцию). Аналогичные опыты можно провести с молочной сывороткой, раствором яичного белка и т.п.

        Работа 2. Цветные реакции на белки.

        К оставшимся от предыдущего опыта двум порциям белкового фильтрата добавить: а) 1 мл 5-10% щелочи и несколько капель сульфата меди – наблюдать фиолетовое окрашивание, указывающее на наличие пептидных связей (биуретовая реакция); б) 0,5 мл 0,5%-ного водного раствора нингидрина и прокипятить в водяной бане 5-10 мин. до появления синего или вишневого окрашивания, что свидетельствует о присутствии в мучной вытяжке веществ, содержащих аминогруппу (свободные аминокислоты, белки).

        Обе реакции можно рассматривать как универсальные цветные реакции на белки. Возможен и другой вариант нингидриновой реакции: на полоску фильтровальной бумаги нанести каплю раствора белка или аминокислоты и после высушивания смочить спиртовым раствором нингидрина; после прогревания бумажной полоски появляется яркое вишневое пятно, соответствующее капле нанесенного образца.

        Работа 3. Цветная реакция с кислым раствором нингидрина (реакция Чинарда).

        Некоторые важные аминокислоты образуют специфическое окрашивание с нингидрином в резко кислой среде (фосфорная + уксусная кислоты). Такую реакцию дают пролин, орнитин, цитруллин, цистеин, лизин.

        К 0,2 мл раствора какой-либо из указанных аминокислот добавить 1 мл конц. уксусной кислоты и 0,1 мл (2 капли) реактива Чинарда. Перемешать и тщательно кипятить в водяной бане 10 –15 мин. Появляется красно-коричневое окрашивание.

        Чтобы обнаружить перечисленные аминокислоты в белке, его необходимо предварительно подвергнуть кислотному гидролизу (нагреть в присутствии 5-6 М соляной кислоты).

                Работа 4. Диазореакция Паули.

                Ещё в 1904 г. Паули предложи очень чувствительную реакцию на гистидин и тирозин: реакцию азосочетания с сульфаниловой кислотой. С помощью этой реакции можно обнаружить гистидин и продукты его распада в смывах с кожи человека и животных (собак, кошек).

        Палец тщательно ополаскивают в стаканчике с небольшим количеством воды (4-5 мл). К полученному смыву последовательно добавить по 0,1 мл (2-3 капли) 1%-ного раствора сульфаниловой кислоты, 0,5%-ного раствора нитрита натрия и 10%-ного раствора карбоната натрия; проба перемешивается, появляется оранжевое окрашивание (кроме гистидина и тирозина, эту реакцию дают гистамин, урокановая кислота, некоторые другие гетероциклы)

        Работа 5. Реакция Сакагучи – цветная реакция на аргинин

        В 20-х годах XX века Сакагучи предложил чувствительную реакцию на аргинин. Эта основная аминокислота входит в состав многих животных и растительных белков. Особенно много её в белках рыб.

        К 1 мл раствора, содержащего аргинин, добавить 0,5 –1 мл 0,1%-ного раствора α-нафтола (или оксина) и столько же щелочного раствора гипобромита натрия, можно использовать разбавленный в 10-20 раз раствор «белизны» или «тексонита». Сразу же появляется красное окрашивание. На холоду цветной продукт более устойчив.

        Работа 6. Реакция на метионин

        Метионин содержит группу CH3 — S (меркаптогруппу), такие соединения в кислой среде образуют с нитропруссидом натрия вишнево-красное окрашивание. К 0,5 мл раствора, содержащего метионин, добавить 1 мл 0,6 %-ного раствора NaOH и 10 %-ного раствора нитропрусида натрия. Пробу выдержать 5 мин при температуре 40˚—50˚С, затем добавить 0,1 мл 30 %-ной серной кислоты. Наблюдать красное окрашивание. Этой реакцией можно воспользоваться для контроля за наличием свободного метионина в комбикормах.

        Работа 7. Ксантопротеиновая реакция.

        Это широко известная цветная реакция на присутствие ароматических аминокислот (особенно тирозина) в белках. При нагревании ароматических аминокислот и белков, их содержащих, с концентрированной азотной кислотой развивается желтое окрашивание за счет нитрования ароматического цикла (образование нитрофенолов).

        К 0,5 мл раствора, содержащего тирозин, добавить 0,5-1 мл концентрированной азотной кислоты. Осторожно нагревать до появления желтого окрашивания. При последующем подщелачивании окраска усиливается. Реакцию дают и другие ароматические соединения, например, фенол.

        Работа 8. Хроматография аминокислот на бумаге.

        Если анализировать образцы, содержащие несколько аминокислот с (растительные соки, экстракты, белковые гидролизаты и т.п.), для разделения и идентификации конкретных аминокислот прибегают к хроматографическому анализу. Самым простым вариантом последнего является хроматография на бумаге. В её основе лежит принцип распределения исследуемых веществ (аналитов) в двух несмешивающихся фазах. Удобнее всего пользоваться восходящей хроматографией.

        На дно стеклянного цилиндра наливается смесь, состоящая из бутанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:1. На полоску хроматографической бумаги (фильтровальная бумага особого качества) на расстоянии примерно 1-2 см от края наносится исследуемый образец, содержащий какие-то аминокислоты, например, валин, глицин, лизин. Полоска бумаги подвешивается в цилиндре так, чтобы конец, возле которого нанесена капля смеси аминокислот, был погружен в спирто-кислотную смесь. Под воздействием капиллярных сил эта смесь начинает подниматься по полоске бумаги. При этом бутиловый спирт движется быстрее, и те аминокислоты, которые лучше растворимы в нем (гидрофобные) поднимаются по бумаге выше, а хорошо растворимые в водной фазе поднимаются невысоко. Таким образом, через несколько часов подъёма смеси аминокислоты, присутствующие в образце, разделяются на отдельные зоны в пределах бумажной полоски. Бумага извлекается из хроматографической камеры, высушивается и смачивается ацетоновым или спиртовым раствором нингидрина, после чего снова хорошо прогревается до появления красно-фиолетовых пятен, соответствующих конкретным аминокислотам. Если хроматографировать параллельно с исследуемой смесью неизвестных аминокислот образцы известных аминокислот («свидетели»), можно по высоте подъёма определить какие аминокислоты содержались в исследуемом образце.

        Поскольку для разделения аминокислот требуется несколько часов, эту работу удобно выполнить в два приёма (на первом занятии поставить хроматограмму, а на следующем её проявить).

        Работа 9. Обнаружение углеводов в белках.

        Помимо простых белков, состоящих только из аминокислот, в природе широко встречаются сложные белки, у которых кроме белкового компонента присутствует простетическая группа. Она может содержать липиды, углеводы, нуклеиновые кислоты. Сложные белки, содержащие углеводный компонент, входят в состав слизей, слюны. Присутствие углеводов можно обнаружить с помощью простой реакции Молиша.

        К 1 мл слюны добавить 5-6 капель 0,2%-ного спиртового раствора α-нафтола, затем наклонив пробирку осторожно подслоить 1 мл концентрированной серной кислоты. На границе слоев возникает усиливающееся фиолетовое кольцо.

        Работа 10. Растворение кератина в крепкой щелочи.

        Кератины – это белки волос, шерсти, рогового вещества. Они практически нерастворимы в воде и относятся к неперевариваемым протеинам. Однако и эти белки можно перевести в растворимое состояние с разрушением структуры кератиновых молекул, если нагревать их в присутствии крепких минеральных кислот и щелочей.

        Комочек шерсти (перо, ноготь и т.п.) поместить в пробирку с 1 мл 20-40%-ного раствора едкого натра и кипятить в течение нескольких минут. Наблюдается полное или частичное исчезновение образца, а щелочной раствор окрашивается в бледно-коричневый цвет. Разлить пробу на 2 части и к одной добавить раствор ацетата свинца. Наблюдается усиление окраски за счёт образования осадка сульфида свинца. К другой части прибавить несколько капель раствора нитропруссида натрия – появляется вишневое окрашивание. Обе реакции указывают на наличие в пробах содержащих серу аминокислот (цистина, цистеина, метионина).

        Задачи по биологической химии. Часть 1.

        1. Нормальное содержание глюкозы в крови составляет 90 мг на 100 г. Вычислить осмотическое давление глюкозы в крови и оценить вклад глюкозы в суммарную величину. (t =37˚ С, газовая постоянная 0,082 )

        2. Концентрация ионов Na + в плазме крови 140 ммоль/л, ионов хлора –100 ммоль/л. Вычислить суммарное осмотическое давление этих ионов при t =37˚С и оценить их вклад в величину осмотического давления плазмы крови.

        3. Концентрация белка в сыворотке крови составляет 7%. Вычислить осмотическое давление белков в сыворотке крови при t =37˚С, если средняя молекулярная масса их составляет 70 000 у.е.

        4. Сыворотка крови замерзает при температуре –0,52˚ С. Вычислить молярную концентрацию сыворотки, если криоскопическая постоянная воды 1,86 град·л/моль.

        5. Вода в колодце замерзает при температуре –0,7˚ С. Вычислить молярную концентрацию солей в этой воде. Годится ли эта вода для питья?

        6. Минеральная вода «Горная поляна» содержит в 1 л хлоридов 1,6 г; катионов натрия 0,46 г; катионов калия 0,78 г. Чему равно осмотическое давление этой воды?

        7. Перечислить буферные системы крови. Вычислить рН гидрокарбонатного буфера, если концентрация гидрокарбоната в 10 раз больше, чем концентрация угольной кислоты (рК H2CO3=6,11). Как называется состояние организма при таком значении рН крови?

        8. При титровании 100 мл молока пошло 3,5 мл 0,1 н. щелочи NaOH. При этом рН молока сместился от 6,7 до 8,4. Вычислить буферную ёмкость этого молока.

        9. С пищей студент должен получать в сутки 2800 ккал энергии. Достаточно ли будет, если студент будет в сутки съедать 400 г углеводов, 80 г белков, 80 г жиров?

        У-1. Что такое N-ацетилглюкозамин? В составе каких полисахаридов его можно обнаружить?

        У-2. Дайте определение следующим терминам: а) углеводы; б) моносахариды; в) дисахариды; г) полисахариды; д) альдозы; е) кетозы; ж) альдопентозы; з) кетогексозы. Проиллюстрируйте эти термины примерами конкретных соединений.

        У-3. Приведите химические реакции, которые доказывают наличие в молекуле глюкозы: а) альдегидной группы; б) спиртовых групп; в) полуацетального гидроксила.

        У-4. Объясните, почему при восстановлении глюкозы образуется один шестиатомный спирт D- сорбит, а при восстановлении D- фруктозы два спирта – D –глюцит и D- маннит.

        У-5. D- фруктоза даёт реакцию серебряного зеркала с реактивом, хотя в ней нет альдегидной группы. Это объясняется енолизацией кетозы под действием основания, приводящей к ендиолу, и последующими равновесными превращениями. Что это за превращения? Какие соединения в действительности реагируют с аммиачным раствором оксида серебра?

        У-6. Какое строение имеет сахароза? Почему она относится к невосстанавливающим сахарам? Приведите схему гидролиза сахарозы. Почему продукт гидролиза называется инвертным сахаром?

        У-7. При метилировании амилозы и последующем гидролизе в качестве главного продукта образуется 2,3,6- три- О- метил-D- глюкоза. Однако получается также около 0,5 % 2,3,4,6 – тетра- О- метил- D- глюкозы. Рассчитать среднее число остатков глюкозы в одной молекуле амилозы.

        У-8. Какие соединения образуются в результате гидролиза гиалуроновой кислоты? Привести их формулы.

        У-9. В чем отличие крахмала и клетчатки по составу, строению, связям, растворимости и наличию водородных связей? Ответ оформить в виде таблицы.

        У-10. В состав каких углеводов входят атомы серы?

        Л-1. Известно, что в крови холестерин содержится главным образом в виде сложного эфира с жирными кислотами. Написать формулу холестеринпальмитата.

        Л-2. Какие липиды содержат одновременно азот и фосфор? Написать формулу такого липида.

        Л-3. Каким образом определить степень ненасыщенности триацилглицерина (жира)? Перечислить типичные непредельные жирные кислоты.

        Л-4. Как изменится реакция среды при гидролизе нейтрального жира? Какие продукты образуются при щелочном гидролизе жира?

        П-1. Изоэлектрическая точка белка казеина равна 4,8. Определить знак заряда этого белка при рН 2,8; при рН 6,5.

        П-2. В состав молекулы белка входят аминокислоты серин, глутамин, цистеин (4 остатка), лизин, аспарагиновая кислота. Какие типы связей возможны в этом белке?

        П-3. Белок содержит большое количество таких аминокислот как валин, фенилаланин, лейцин, изолейцин, цистеин. Какие типы связей будут формировать структуру такой белковой молекулы? Что можно сказать о растворимости этого белка в воде?

        П-4. В 10 г белка пшеницы содержится

Какова будет реакция среды водного раствора этого белка?

        П-5. Стандартный кормовой белок ФАО содержит 50 мг валина в 1 г. Вычислить скор валина в белке коллагене, если содержание этой аминокислоты в коллагене составляет 34 мг/г.

        П-6. Вычислить скор лизина в казеине, если в казеине содержание этой аминокислоты 63 мг/г, а стандартном белке ФАО 55 мг/г

        П-7. Написать формулы 4 незаменимых аминокислот. Какие белки имеют высокое содержание незаменимых аминокислот?

        П-8. Написать формулу аминокислот аргинина и глутаминовой кислоты. Вычислить процентное содержание азота в этих аминокислотах.

        П-9. Глутатион – природный трипептид, содержащийся в крови, состоит последовательно из глутаминовой кислоты, цистеина, глицина. Написать формулу глутатиона, учитывая, что глутаминовая кислота участвует в пептидной связи γ -карбоксильной группой. Как будет заряжена молекула глутатиона в нейтральной среде?

        П-10. Местный гормон брадикинин состоит из 9 аминокислот в следующей последовательности: аргинил- пролил- пролил –глицил ––серил –пролил –фенилаланил –аргинин. Написать формулу брадикинина. Как будет заряжена его молекула в нейтральной среде?

        П-11. Ангиотензин II, пептид, резко повышающий кровяное давление, состоит последовательно из аспарагиновой кислоты, аргинина, валина, тирозина, изолейцина, гистидина, пролина, фенилаланина. Написать формулу этого октапептида.

        П-12. Написать формулы пуринового и пиримидинового мононуклеотидов. Соединить их так, как они связаны в нуклеиновых кислотах.

        П-13. Белок лосося сальмин состоит из 58 аминокислотных остатков, из них 40 остатков аргинина. Вычислить % -ное содержание аргинина в сальмине. Какие реакции будут давать водные растворы этого белка.

        П-14. Вычислить процентное содержание азота в следующих аминокислотах: а) аланин; б) аргинин; в) пролин.

        П-15. При влажном сжигании 0,5 г комбикорма (по Кьельдалю) определено, что в этой навеске содержится 30 мг азота. Вычислить % -ное содержание в комбикорме сырого протеина. Оценить этот комбикорм с точки зрения содержания белка.

        Ф-1. Перечислить ферменты, расщепляющие пептидную связь. Какова биологическая роль этих ферментов. Написать реакцию гидролиза трипептида глицил –аланил –лизина.

        Ф-2. В сыром молоке содержится фермент липаза. Написать реакцию, которую ускоряет этот фермент. Как обнаружить липазную активность в молоке?

        Ф-3. Натуральный мёд содержит фермент амилазу. Что делает этот фермент? Как обнаружить активность амилазы?

        Ф-4. Что такое ингибиторы ферментов, и какие виды ингибирования известны? Биологическое значение ингибирования ацетилхолинэстеразы.

        Ф-5. Что такое сродство фермента к субстрату? Какие существуют способы количественной оценки этого понятия?

        ЛИТЕРАТУРА

        1. Алейникова Т.Л., Рубцова Г.В. руководство к практическим занятиям по биохимии. М.: Высш. шк., 1988

        2. Анисимов А.А. и др. М.: Высш. шк., 1986

        3. Кухта В.К. и др. М.: Медицина, 1999

        4. Слесарев В.И. Основы химии живого. С.-Пб.: Химиздат, 2000

        5. Тюкавкина Н.А., Бауков Ю.И. Биоорганическая химия. М.: Медицина, 1991

        6. Храмов В.А. Колориметрические методы анализа азотистых соединений. Волгоград, 1979

        7. Храмов В.А. Протеины. Ферменты. Волгоград, 1995

        8. Храмов В.А., Павловская М.М., Тырина С.М. Химия липидов. Волгоград, 1997.

Галактозамин

Глюкозамин

N - ацетилглюкозамин

 O

OH

H

H

OH

— O —

СH2OH

H

 O

OH

H

H

NH2

OH

H

СH2OH

H

 HО

    H

 O

OH

H

H

OH

— O —

СH2OH

H

...O

O=C—CH3

ЛИПИДЫ

неомыляемые

простые

омыляемые

сложные

воски

нейтральные жиры (ТАГ)

высшие спирты, стеролы

высшие углеводороды, терпеноиды, каротины

фосфолипиды

гликолипиды

сульфолипиды

COOH

R2 — C — O — CH

H2C — O — P — O — R3

H2C — O — C — R1

=

—

—

O

=

O

—=

O-

CH3 — ( CH2)12 — CH = CH — СН— CH — NH2

OH

CH2OH

—

—

фосфорная кислота

ХОЛИН

жирная кислота

СФИНГОЗИН

ХОЛИН,

        ЭТАНОЛАМИН

ФОСФОРНАЯ КИСЛТА

ГЛИЦЕРИН

+

—

ацилы
жирных кислот

H

CH3

—

CH3 — ( CH2)12 — CH = CH — CH — CH — N — C — CH — (CH2)n

=

OH

O

—

—

— O — CH2

OH

—

—

ГАЛАКТОЗА

СФИНГОЗИН

жирная кислота

ГЛЮКОЗА

ГАЛАКТОЗА

сиаловая кислота

n

O=C—CH3

 O

H

NH

O...

H

    H

 HO

СH2OH

H

 O

OH

H

H

OH

O

СH2OH

H

...O

n

O=C—CH3

 O

OH

H

H

NH

O...

H

    H

 ...

СH2OH

H

 O

OH

H

H

OH

— O...

СH2OH

H

 O

OH

H

H

NH

OH

H

    H

 ОH

СH2OH

H

 O

OH

H

H

NH2

OH

H

СH2OH

H

    H

OH

n

O=C—CH3

 O

NH

O...

Н

    H

 HO

СH2OH

H

 O

OH

H

H

OH

O

СH2OH

H

...O

n

O=C—CH3

 O

OH

H

NH

O...

Н  

    H

 ...

СH2OH

H

 O

OH

H

H

OH

— O...

СH2OH

H

 O

OH

H

H

OH

— O —

СH2OH

H

 O

OH

H

H

OH

— O —

СH2OH

H

...O