Методическая разработка "ИЗУЧЕНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СТРЕПТОКОККОВЫХ ИНФЕКЦИЙ»
методическая разработка

Государственное бюджетное профессиональное образовательное учреждение

Департамента здравоохранения города Москвы

«Медицинский колледж № 1»

(ГБПОУ ДЗМ МК № 1)

МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА

ПРАКТИЧЕСКОГО ЗАНЯТИЯ

По теме: «ИЗУЧЕНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ  ДИАГНОСТИКИ СТРЕПТОКОККОВЫХ ИНФЕКЦИЙ»

Специальность: 31.02.03 Лабораторная диагностика,  

базовый уровень

2 курс, 3 семестр

Москва 2019

Стрептококки.
Относятся к семейству Streptococcaceae, роду Streptococcus.

Это грамположительные кокки, в мазках располагаются цепочками или попарно. Являются факультативными анаэробами. Не растут на питательных средах. На кровяном агаре дают мелкоточечные беспигментные колонии, окруженные зоной гемолиза: а — зеленящий, прозрачный. Заболевание чаще вызывается гемолитическим стрептококком. В сахарном бульоне дают придонно-пристеночный рост, а сам бульон остается прозрачным. Растут при температуре 37 °С. Стрептококки способны расщеплять аминокислоты, белки, углеводы. По биохимическим свойствам выделяют 21 вид. Большинство из них условно-патогенные.

Наибольшее значение в развитии инфекционных заболеваний имеют:

1. S. pyogenus, возбудитель специфической стрептококковой
   инфекции;
2. S. pneumonia, возбудитель пневмонии, может вызывать
   ползучую язву роговицы, отиты, сепсис;
3. S. agalactia, может входить в состав нормальной микро
   флоры влагалища; инфицирование новорожденных приводит
   к развитию у них сепсиса и менингита;
4. S. salivarius, S. mutans, S. mitis, входят в состав нормальной
   микрофлоры полости рта; при дисбиозе ротовой полости являются ведущими факторами в развитии кариеса.

Хотя многочисленные представители рода Streptococcus в норме составляют значительную долю нормальной микрофлоры пищеварительного, дыхательного и генитального тракта, некоторые из них могут вызывать оппортунистические инфекции разной локализации и тяжести: фарингиты, ангины, отиты, пневмонии, скарлатину и другие заболевания дыхательного тракта и ЛОР-органов; рожистое воспаление, флегмоны, нагноения ран и другие заболевания кожи и подкожной клетчатки; послеродовые гнойно-воспалительные осложнения, менингит, сепсис. Тяжелыми осложнениями стрептококковой инфекции являются ревматизм и гломерулонефрит.

При заболеваниях, вызванных стрептококками, материалом для исследования, в зависимости от локализации и формы инфекции, являются гной, кровь, отделяемое слизистой оболочки, моча, мокрота, спинномозговая жидкость, раневое отделяемое. Берут его так же, как при заболеваниях, вызванных стафилококками. При взятии материала из полости рта ополаскивание не проводят, а интервал после приема пищи должен быть не менее 2 ч. Если материал невозможно доставить в лабораторию в течение 2 ч, его помещают в транспортные среды или среду накопления (сахарный бульон, тиогликолевая среда).

Микроскопия. В мазках из гноя, отделяемого слизистой оболочки, окрашенных по Граму, стрептококки располагаются короткими цепочками, иногда в виде диплококков или единичных кокков. В последнем случае стрептококки нельзя отличить от стафилококков, поэтому для более детального изучения обнаруженных кокков обязательно проводят бактериологическое исследование. Это необходимо и для правильного выбора препаратов этиотропного лечения. В качестве экспресс-диагностики иногда стрептококки определяют в нативном материале методом иммунофлюоресценции.

^ Бактериологическое исследование. Гной, отделяемое слизистой оболочки, мочу, мокроту, спинномозговую жидкость сеют в чашку Петри с 5%м кровяным агаром (лучше использовать дефибринированную баранью кровь) и в пробирку с сахарным бульоном. Для выделения стрептококков из контаминированного материала используют селективные среды (в кровяной агар и среду накопления вводят антибиотики — колистин, налидиксовую кислоту, которые подавляют рост сопутствующих микроорганизмов). Хотя стрептококки дают рост на воздухе, посевы лучше инкубировать в анаэробной атмосфере при 37 "С. Инкубация в атмосфере СО2 стимулирует рост бетагемолитических стрептококков, не относящихся к группе А. С этими целями применяют анаэростат или эксикатор с горящей свечой.

Через 24 — 48 ч изучают колонии и рост в сахарном бульоне. В сахарном бульоне большинство пиогенных стрептококков дает придонный или пристеночный рост в виде хлопьев или зерен, вся среда остается прозрачной, другие стрептококки могут давать интенсивное помутнение среды с образованием компактного осадка. На плотных средах Streptococcus pyogenes растет с образованием нескольких типов колоний: мелких, плоских, суховатых колоний зернистой структуры (вирулентные штаммы, содержащие Мпротеин); относительно крупных, блестящих, вязких с ровным краем (вирулентные, содержащие капсулу). По росту на кровяных средах выделяют три группы стрептококков: гемолитические (вызывают полный гемолиз эритроцитов с обесцвечиванием и просветлением среды вокруг колоний), агемолитические (вызывают неполный гемолиз с формированием зеленоватой зоны вокруг колоний, обусловленной образованием метгемоглобина) и негемолитические (среда вокруг колоний не изменена). «Зеленящие» стрептококки образуют блестящие или матовые мелкие колонии сероватого цвета. Негемолитические стрептококки, как правило, не имеют клинического значения. В окрашенных мазках из колоний стрептококков не отмечается типичного расположения кокков в виде цепочек. Клетки располагаются одиночно, попарно или небольшими скоплениями. В мазке из культуры в жидкой среде обнаруживают типичные цепочки стрептококков.

Подозрительные колонии пересевают на кровяной агар или в бульонную среду для накопления чистой культуры и ее дальнейшей идентификации. В ходе идентификации учитывают культурально-морфологические особенности культуры, ставят каталазный тест, определяют группу, вид и серовар стрептококка.

Группы стрептококка классифицируют по наличию полисахаридного антигена, для выявления которого используют реакцию преципитации с групповыми сыворотками {А, В, Си т.д.). Подавляющее большинство стрептококков группы А относятся к виду S. pyogenes, поэтому нередко данные названия используют как синонимы. Для быстрого определения группы стрептококка применяют реакцию латексагглютинации или коагглютинации с диагностикумами, «нагруженными» антителами соответствующих групповых сывороток (реакцию ставят с антигенными экстрактами из исследуемого материала или культур на различных этапах бактериологического исследования). Большинство клинически значимых стрептококков относится к группе А.

Чувствительность стрептококков к антибиотикам во многом прогнозируема, однако появляются сообщения об устойчивости некоторых штаммов, в частности, к пенициллинам, поэтому у выделенной культуры проверяют чувствительность к антимикробным препаратам.

^ Исследование крови. Посев крови в сахарный бульон или специальную среду для выделения гемокультур стафилококков производят так же, как при стафилококковых заболеваниях. При наличии стрептококка на дне флакона появляется хлопьевидный придонный осадок. В мазках обнаруживаются длинные цепочки стрептококков. Микроскопия позволяет дать предварительный ответ о наличии или отсутствии стрептококка. Для выделения чистой культуры и определения характера гемолиза делают пересев в чашку с кровяным агаром. Через сутки (3й день исследования) появляются типичные мелкие колонии, окруженные зоной гемолиза. Дальнейшие этапы исследования описаны выше.

Для диагностики скарлатины, как правило, лабораторные исследования не применяют. В отдельных случаях высевают отделяемое слизистой оболочки зева и выделяют стрептококки различных серогрупп.

^ Серологическое исследование. Серодиагностику стрептококковых инфекций проводят у больных хронически текущими заболеваниями, леченных большими дозами антибиотиков и сульфаниламидных препаратов, т. е. когда выделение возбудителя бактериологическими методами представляет большие трудности, а также при оценке активности ревматического процесса, выявлении микробоносительства. Она предусматривает определение в крови специфических стрептококковых антител к токсинам, в частности к стрептолизину О и гиалуронидазе.

Стрептококки являются основными обитателями полости рта. В 1 мл слюны содержится до 108 - 109 стрептококков. Тем не менее, в пробах слюны их примерно в 2 раза больше, чем в материале из бляшки или десневого желобка. Наиболее значительной группой стрептококков полости рта следует считать микроаэрофильные а-гемолитические ("зеленящие") стрептококки и негемолитические формы. Следует отметить, что от 40 - 90 % штаммов вида milled могут быть В-гемолитическими, которые принимают активное участие в процессах, приводящих к поражениям твердых тканей зуба и пародонта. В эту группу входят Streptococcus mutants, S. sanguis, S. mitis, S. salivarium. Они отличаются друг от друга по способности ферментировать углеводы и образовывать перекись водорода.

Сдвиг рН в кислую сторону приводит к декальцинации зубной эмали. Особо следует подчеркнуть высокие способности микроаэрофильных стрептококков к аггрегации с другими бактериями, которые показаны, в частности, в отношении актиномицетов, фузобактерий, лактобактерий. Все это способствует обнаружению данных видов в составе ассоциаций возбудителей при различных гнойно-воспалительных процессах в челюстно-лицевой области. Но особенно значительна их роль в развитии кариеса. Ведущее место в этом плане занимают два вида, активно продуцирующие из углеводов пищи молочную и другие кислоты на эмали -S. mutans и S. sanguis.

Все виды стрептококков плохо растут и погибают на простых питательных средах, т.к. в процессе роста и размножения стрептококки выделяют много перекиси водорода, которая действует на них губительно, т.к. они не продуцируют каталазу. Для создания оптимальных условий роста к питательной среде обычно добавляют кровь, в которой содержится каталаза, разрушающая перекись водорода. На кровяных средах стрептококки хорошо растут в аэробных условиях, при этом одни из них образуют на кровяном агаре колонии, окруженные зоной полного гемолиза (это гемолитические (В) стрептококки), другие окружены зоной зеленоватого цвета (зеленые стрептококки), у третьих (у) гемолиз отсутствует (негемолитические стрептококки).

Стрептококки выделяют экзотоксин и ферменты агрессии. Во внешней среде менее устойчивы, чем стафилококки. Большинство чувствительны к пенициллину и другим антибиотикам. По антигенной структуре все стрептококки делят на 17 серологических групп (A,B,C,D, .... и до S), чаше других в полости рта обнаруживаются стрептококки групп А, С, D, F, G, Н и О.

Рис. Колонии стрептококка.

Стрептококки полости рта. Отдел Firmicutes, семейство Streptococcaceae, род Streptococcus. В род Streptococcus входят более 20 видов, среди которых есть представители нормальной микрофлоры человеческого тела и полости рта, а также возбудители тяжелых инфекционных эпидемических заболеваний человека.

Стрептококки — мелкие (меньше 1 мкм) шаровидные клетки, располагающиеся цепочками или попарно, грамположительны, спор не образуют, неподвижны. Большинство штаммов стрептококков образуют капсулу, состоящую из гиалуроновой кислоты. Клеточная стенка содержит белки (М-, Т- и R-антигены), углеводы (группоспецифические) и пептидогликаны. Легко переходят в L-формы.

Генетический обмен возможен за счет трансформации и трансдукции, но не конъюгации. Устойчивость к антибиотикам вырабатывается медленно.

Стрептококки группы А вырабатывают более 20 внеклеточных веществ, обладающих антигенной активностью. Наибольшее значение в патогенезе стрептококковых инфекций имеют:

• 
  стрептокиназа (фибринолизин) — протеолитический фермент, расщепляющий фибрин и другие белки;
• 
  ДНК-аза — фермент, деполимеризующий ДНК. Смесь ДНК-азы и фибринолизина способна разжижать экссудаты, лизировать венозные тромбы, поэтому может быть использована для удаления гноя и некротизированных тканей из раны;
• 
  гиалуронидаза — фермент агрессии, разрушающий гиалуроновую кислоту, входящую в состав соединительной ткани («фактор проницаемости»);
• 
  эритрогенин — токсин, продуцируемый р-гемолитическими стрептококками группы А, способными вызывать скарлатину. Выделяется только лизогенными культурами.

Стандартизованный разведенный эритрогенин используют при постановке внутрикожной пробы (проба Дика) для выявления чувствительности к этому токсину (восприимчивость к скарлатине).

Стрептококки являются основными обитателями полости рта. В 1 мл слюны содержится до 108 - 109 стрептококков. Тем не менее, в пробах слюны их примерно в 2 раза больше, чем в материале из бляшки или десневого желобка. Наиболее значительной группой стрептококков полости рта следует считать микроаэрофильные а-гемолитические ("зеленящие") стрептококки и негемолитические формы. Следует отметить, что от 40 - 90 % штаммов вида milled могут быть В-гемолитическими, которые принимают активное участие в процессах, приводящих к поражениям твердых тканей зуба и пародонта. В эту группу входят Streptococcus mutants, S. sanguis, S. mitis, S. salivarium. Они отличаются друг от друга по способности ферментировать углеводы и образовывать перекись водорода.

Сдвиг рН в кислую сторону приводит к декальцинации зубной эмали. Особо следует подчеркнуть высокие способности микроаэрофильных стрептококков к аггрегации с другими бактериями, которые показаны, в частности, в отношении актиномицетов, фузобактерий, лактобактерий. Все это способствует обнаружению данных видов в составе ассоциаций возбудителей при различных гнойно-воспалительных процессах в челюстно-лицевой области. Но особенно значительна их роль в развитии кариеса. Ведущее место в этом плане занимают два вида, активно продуцирующие из углеводов пищи молочную и другие кислоты на эмали -S. mutans и S. sanguis.

Все виды стрептококков плохо растут и погибают на простых питательных средах, т.к. в процессе роста и размножения стрептококки выделяют много перекиси водорода, которая действует на них губительно, т.к. они не продуцируют каталазу. Для создания оптимальных условий роста к питательной среде обычно добавляют кровь, в которой содержится каталаза, разрушающая перекись водорода. На кровяных средах стрептококки хорошо растут в аэробных условиях, при этом одни из них образуют на кровяном агаре колонии, окруженные зоной полного гемолиза (это гемолитические (В) стрептококки), другие окружены зоной зеленоватого цвета (зеленые стрептококки), у третьих (у) гемолиз отсутствует (негемолитические стрептококки).

Стрептококки выделяют экзотоксин и ферменты агрессии. Во внешней среде менее устойчивы, чем стафилококки. Большинство чувствительны к пенициллину и другим антибиотикам. По антигенной структуре все стрептококки делят на 17 серологических групп (A,B,C,D, .... и до S), чаше других в полости рта обнаруживаются стрептококки групп А, С, D, F, G, Н и О.

Ситуационные задачи:


1. При микроскопическом исследовании отделяемого фурункула выделен S. аureus. К какой группе представителей нормальной микрофлоры кожи относится этот микроорганизм?


2. На каких из перечисленных сред выращивают стафилококки и каике среды целесообразно использовать при проведении бактериологического исследования?

а) МПБ или МПА;

б) молочно-солевой агар

в) желчный бульон

г) кровяной агар

д) сахарный агар или бульон

е) желчно-солевой агар


3. Какая среда является селективной для стрептококков? Что обеспечивает селективность этой среды?


4. Каковы особенности строения клеточной стенки стафилококков и стрптококков по сравнению со строением клеточной стенки грамотрицательных бактерий?


5. Какие ферменты патогенности продуцируют стафилококки? Какова их роль в патогенезе инфекции?


6. Какие клетки, кроме эритроцитов, может повреждать ₤ - токсин?

7. Чем объясняют кардиотоксический, дерматотоксический и нейротоксический эффекты α - токсина?