Получение полиэлектролитных капсул с магнетитом, определение эффективности загрузки доксорубицина

Слайд 1

НИЦ « Курчатовский институт » Государственное бюджетное образовательное учреждение «Школа №1582» Авторы: Хегай Владимир Евгеньевич 10В Научный консультант: Саруханова Виктория Витальевна, сотрудник ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН Лаборатория биоорганических структур Руководитель: Сюкиева Людмила Дорджиевна , учитель физики Москва, 2023-2024 у.г . Получение полиэлектролитных капсул с магнетитом, определение эффективности загрузки доксорубицина Исследовательская работа

Слайд 2

Основная идея работы Работа посвящена изучению полиэлектролитных капсул с добавлением доксорубицина . Полые микрокапсулы получают методом послойной адсорбции с последующим растворением ядра. В ходе работы получали капсулы с магнититом в оболочке. Частицы были включены в оболочку между полиэлектролитными слоями. Для практического применения капсул необходимо уменьшать размер до нанометрового с последующей загрузкойй доксорубицинна . С помощью термического сжатия мы добились уменьшения размеров капсул. Нагревали суспензии при различных температурах и по снимкам СЭМ смотрели изменения, происходящие с оболочкой и размером капсул. Также с помощью метода динамического светорассеяния определяли дзета -потенциал капсул до и после нагрева суспензии. Далее произвели анализ полученных данных. Выяснили что с увеличением температуры инкубации, капсулы уменьшаются в размере, оболочка становится более гладкой и плотной, а дзета -потенциал увеличивается. Полученные капсулы были загружены доксорубицином . Мы убедились, что получение полиэлектролитных многослойных капсул представляет большой интерес из-за их потенциального применения в качестве систем доставки лекарствс контролируемым высвобождением инкапсулированного компонента, в качестве сенсорных систем, каталитических систем и др. Гипотеза: Существует утверждение, что включение магнитных наночастиц в состав полимерной оболочки не препятствует термоиндуцированному сжатию капсул и позволяет повысить эффективность загрузки доксорубицина в капсулы и использовать их в качестве “ доставщика ” лекарственных препаратов. Актуальность Одним из перспективных направлений в данной области является получение полиэлектролитных капсул, оболочка которых модифицирована наночастицами магнетита с добавление доксорубицина , благодаря возможности локального нагрева магнитным полем они находят ряд применений, особенно при лечении опухолей.

Слайд 3

Объект исследования : полиэлектролитные капсулы с магнетитом в оболочке и с доксорубицином внутри. Предмет иссследования : эффективность загрузки доксорубицина в полиэлектролитные капсулы с магнетитом в оболочке. Основное содержание работы Цель работы : Получение полиэлектролитных капсул с магнетитом, с целью дальнейшего изучения эффекивности загрузки доксорубицина в них. 1. Изучить и проанализировать литературу по данной теме 2. Получить капсулы на основе полимеров PSS/PDADMAC. 3. Включить в часть капсул наночастицы магнетита. 4. Исследовать и изучить эффективность загрузки доксорубицина в капсулы с магнетитом. Этапы I этап. Подготовительный. Выбор темы, составление плана работы. II этап. Теоретический. Изучение и анализ литературы по данной теме. I I I этап. Основной этап. Экспериментальный. Проведение экспериментов, исследование образцов. IV этап. Заключительный. Анализ и обработка полученных результатов. Выводы.

Слайд 4

Почему мы использовали частицы карбоната кальция (CaCO 3 ) Для создания ядер для получения многослойных капсул можно использовать широкий спектр материалов. Однако перспективным типом ядер для получения капсул являются частицы CaCO 3 . CaCO3 КАЛЬЦИТ АРАГОНИТ ВАТЕРИТ Т ермодинамически наиболее стабилен Т ермодинамически менее стабилен, но часто встречается в природе. Термодинамически метастабильная форма , редко встечающаяся в природе Для создания капсул используются сферические частицы ватерита , которые перспективны из-за их высокой площади поверхности и пористости. Последнее способствует захвату биологических молекул и лекарств в пористую структуру ватерита для доставки с последующим высвобождением вещества посредством самих частиц, а также капсул, сформированных на их основе CaCl 2 + Na 2 CO 3 →2 NaCl + CaCO 3 CaCO3 обладает важными свойствами : растворимость в мягких условиях (температура, pH ), пористость биосовместимость

Слайд 5

Рисунок 1- Синтез полых полиэлектролитных микрокапсул с использованием карбоната кальция (CaCO3). Получение капсул Для создания многослойной полиэлектролитной оболочки на поверхности частиц используются 2 раствора (раствор полианиона и раствор поликатиона ). Механизм электростатической адсорбции заключается в следующем: частицы, обладающие поверхностным зарядом (например, положительным), помещают в раствор противоположно заряженного полиэлектролита ( полианиона ). Молекулы полианиона осаждаются на частицы, перезаряжая поверхность. В процессе адсорбции происходит ее насыщение и на поверхности частицы формируется полиэлектролитный слой с толщиной в несколько нм . При достижении определенной толщины многослойной оболочки, частицы могут быть растворены, в результате чего образуется полая многослойная капсула .

Слайд 6

СЭМ-изображение частиц карбоната кальция На основе частиц карбоната кальция были получены полые многослойные полиэликтролитные капсулы Рисунок 4 - СЭМ-изображение частиц карбоната кальция

Слайд 7

Наночастицы магнетита В данной работе были использованы наночастицы магнетита(Fe3O4) со средним размером: 18,5 нм . Рисунок 5 - ПЭМ-изображение наночастиц магнетита

Слайд 8

Рисунок 2-Концепция использования магнитных наночастиц в онкологии Целевая доставка с помощью наночастиц магнетита В настоящее время широкое применение получили биосовместимые частицы оксида железа, что связано с их низкой токсичностью и хорошей стабильностью. Наиболее подходящими среди модификаций оксида железа является магнетит ( Fe 3 O 4 ) [17], который не проявляет токсических свойств. Было установлено, что мелкодисперсный магнетит выводится из кровяного русла через 1-6 ч после внутривенного или внутриартериального введения и перераспределяется по органам и тканям. Отмечено, что наночастицы Fe 3 O 4 приблизительно к концу второй недели после введения полностью выводятся из организма.

Слайд 9

Наночастицы магентита Изображение наночастиц магнетита с помощью ПЭМ А) – СЭМ-изображение многослойных полиэлектролитных капсул без наночастиц , Б) – СЭМ – изображение капсул, модифицированных наночастицами магнетита. Рисунок 6 - А) – СЭМ-изображение многослойных полиэлектролитных капсул без наночастиц , Б) – СЭМ – изображение капсул, модифицированных наночастицами магнетита. А) Б) Рисунок 5 - ПЭМ-изображение наночастиц магнетита

Слайд 10

Рисунок 3- Структурная формула доксорубицина Включение лекарственных веществ в оболочку капсул Загрузка активных веществ в капсулы может осуществляться различными способами. В первом случае активное вещество предварительно адсорбируется на пористом ядре с последующим формированием многослойной полиэлектролитной оболочки на его поверхности. Во втором случае сначала формируется полая капсула, которую потом заполняют биологически активным веществом. К настоящему времени проведены работы по капсулированию различных лекарств в полые капсулы. Одним из наиболее часто применяемых препаратов является доксорубицин (ДОКС). Известно , что антираковый препарат доксорубицин эффективен, но обладает низкой биодоступностью . Улучшить биодоступность доксорубицина можно включив его в микромолекулярные наноконтейнеры .

Слайд 11

Методы исследования Метод СЭМ Сканирующий электронный микроскоп - прибор, основанный на взаимодействии электронного пучка с веществом, предназначенный для получения изображения поверхности объекта с высоким пространственным разрешением, а также о составе и строении приповерхностных слоёв. Метод ПЭМ устройство для получения изображения с помощью проходящего через образец пучка электронов . Спектрофотометрия физико-химический метод исследования растворов и твёрдых веществ, основанный на изучении спектров поглощения в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной областях спектра.

Слайд 12

Ход исследований и эксперименты Как упоминалось ранее, для создания полиэлектролитной оболочки на частицах используется метод полиионной сборки. Данная методика заключается в поочередном нанесении противоположно заряженных полиэлектролитов на поверхность ватерита . Этим методом на поверхность частиц карбоната кальция были нанесены слои полистиролсульфоната ( PSS ) и полидиалилдиметиламммония хлорида. Растворы полиэлектролитов имели концентрацию 2 мг/мл в 0,5М растворе NaCl . Для этого к 60 мг CaCO 3 добавляли 1 мл PSS , образцы выдерживались на шейкере при скорости 1000 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем осаждались центрифугированием и промывались 3 раза деионизованной водой для удаления остатков растворов полиэлектролитов. Далее к частицам, покрытым слоем PSS , добавляли 1 мл раствора PDADMAC . Затем также образцы выдерживали на шейкере, осаждали и трехкратно промывали деионизованной водой. Таким образом, формируется бислой , состоящий из слоя полианиона и поликатиона . При многократном повторении процедуры образуется многослойная оболочка. В результате были получены капсулы следующего состава: (PSS/PDADMAC/PSS/PDADMAC/PSS/PDADMAC)

Слайд 13

Расстворение ядра Полые полиэлектролитные микрокапсулы получали путем растворения ядер кальция карбоната при добавлении тринатриевой соли этилендифминтетрауксуной кислоты (ЭДТА). В результате реакции происходит удаление кальция из капсул за счет образования устойчивого комплекса с ЭДТА. 1 мл 0,2 М водного раствора ЭДТА приливали к суспензии капсул, выдерживали на шейкере на протяжении 5 минут и осаждали центрифугированием. Данный процесс повторяли до полного растворения частиц карбоната кальция. После этого образцы промывали деионизованной водой от остатков ЭДТА. Полученные полые полиэлектролитные капсулы хранили при температуре 4°С в виде водной суспензии.

Слайд 14

Включение в оболочку капсул доксорубицина Загрузку лекарственного препарата доксорубицина проводили в капсулы PSS / PDADMAC / PSS / Mnp / PDADMAC / PSS / Mnp / PDADMAC и ( PSS / PDADMAC ) 3 . Для этого в суспензию капсул добавляли по 500 мкл раствора доксорубицина . Затем на протяжении 60 минут один образец выдерживали на шейкере 1000 об/мин, а другой инкубировали при температуре 90 в термостате. Количество доксорубицина , включенного в микроконтейнеры , определяли спектрофотометрически . Для этого были измерены спектры поглощения доксорубицина в супернатантах инкубированных при комнатной температуре и при 90 ºС в термостате. По полученным спектрам определили оптическую плотность раствора доксорубицина ( D (Полученные полиэлектролитные капсулы являются сферическими. Для дальнейшего их практического применения необходимо уменьшить размер до субмикронного. С этой целью был использован процесс термоиндуцированного сжатия .) Рисунок 3- Структурная формула доксорубицина

Слайд 15

Температурному воздействию были подвергнуты капсулы следующего состава: (PSS/PDADMAC) 3 , PSS/PDADMAC/PSS/ Mnp /PDADMAC/PSS/ Mnp /PDADMAC Суспензии капсул инкубировали при 90ºС в течении 60 минут. На изображении 7 представлены полученные капсулы после нагрева суспензий. 1мкм А) Б) Рисунок 7- СЭМ-изображения капсул: А)- PSS / PDADMAC / PSS / / PDADMAC / PSS / / PDADMAC при 90ºС, Б)- PSS / PDADMAC / PSS / Mnp / PDADMAC / PSS / Mnp / PDADMAC при 90ºС При увеличении температуры инкубации 90ºС происходит изменение размера и морфологии полиэлектролитных капсул .

Слайд 16

А) Б) На рис.(А) приведена полученная калибровочная прямая для определения концентрации доксорубицина , а также конфокальное изображение, демонстрирующее флуоресценцию от доксорубицина , загруженного в капсулы (рис Б). Рисунок 8 А ) Калибровочная прямая для доксорубицина Б) Конфокальное изображение капсул с доксорубицином

Слайд 17

Определение эффективности загрузки доксорубицина капсулы PSS/PDADMAC/PSS/PDADMAC/PSS/PDADMAC . D=8,01755C+0,1747 , C ( доксорубицина ) =29 мкг / мл В каждый образец добавляли 14,5 мкг вещ- ва Рисунок 9 - Спектр поглощения доксорубицина в супернатанте для капсул ( PSS / PDADMAC ) 3 (загрузку проводили при 25 ºС и 90 ºС) D1=0,5466 отн.ед D2=0,52116 отн.ед . C1 (в супернатанте ) = 13,5мкг / мл C2 (в супернатанте ) =1 2 ,7 мкг / мл Для определения массы, взяли 1 мл раствора, определили концентрацию вещ- ва в нём, далее из общей концентрации вычли концентрацию вещ- ва в супернатанте : C-C1=1 мкг C-C2=1,8 мкг Рис.7 Конфокальное изображение капсул с включенным доксорубицином Оптическая плотность ( D ) Длина волны ( нм )

Слайд 18

D= 8 ,01755C+0,1747 , C ( доксорубицина ) =29 мкг / мл В каждый образец добавляли 14,5 мкг вещ- ва Определение эффективности загрузки доксорубицина в капсулы с наночастицами магнетита Рисунок 10- Спектр поглощения доксорубицина в супернатанте для капсул PSS / PDADMAC / PSS / Mnp / PDADMAC / PSS / Mnp / PDADMAC (загрузку проводили при 25 ºС и 90 ºС) Для определения массы, взяли 1 мл раствора, определили концентрацию вещ- ва в нём, далее из общей концентрации вычли концентрацию вещ- ва в супернатанте : C-C1= 4,3 мкг C-C2= 5 мкг D1=0,5 84 отн.ед D2=0,5 32 11 4 отн.ед C1 (в супернатанте ) = 10,2мкг / мл C2 (в супернатанте ) = 9 , 5мкг / мл Оптическая плотность ( D ) Длина волны ( нм )

Слайд 19

Вывод : 1.Синтезированы капсулы ( PSS / PDADMAC ) 3 , ( PSS / PDADMAC / PSS / Mnp / PDADMAC / PSS / Mnp / PDADMAC ) 2. Изучено влияние температурного воздействия на размер и морфологию поверхности капсул. Размер капсул ( PSS / PDADMAC ) 3 уменьшается с 5,6±0,3 мкм до 1,0±0,3 мкм в результате их инкубирования при температуре 90°С. Размер капсул с магнетитом уменьшается с 5,6±0,3 мкм до 0.8±0,3 мкм в тех же условиях. Таким образом, наличие наночастиц в оболочке не препятствует термоиндуцированному сжатию капсул. 3. Спектрофотометрически определена эффективность включения доксорубицина в капсулы. Было обнаружено, что эффективность загрузки вещества в капсулы с магнетитом выше, чем в капсулы без наночастиц . Масса доксорубицина , загруженного в капсулы ( PSS / PDADMAC ) 3 составила 1 мкг для загрузки 25ºС и 1,8 мкг для загрузки при 90 ºС. Для капсул ( PSS / PDADMAC / PSS / Mnp / PDADMAC / PSS / Mnp / PDADMAC ) загрузка составила 4,3 мкг (при 25ºС ) и 5 мкг (90 ºС).

Слайд 20

Перспектива Методика поочередной адсорбции приводит к эффективному включению частиц магнетита в состав оболочек полиэлектролитных многослойных микрокапсул, что демонстрируют результаты проведённых исследований. Установлено, что включение магнитных наночастиц в состав полимерной оболочки не препятствует термоиндуцированному сжатию капсул и позволяет повысить эффективность загрузки доксорубицина в капсулы. Таким образом модификация капсул магнитными наночастицами открывает дополнительные возможности в направленном транспорте лекарственных препаратов. Полученные капсулы могут найти применение как в качестве носителей различных терапевтических агентов, так и в качестве каталитической системы клеточных процессов.

Слайд 21

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ! 21