Методика изготовления постоянных микропрепаратов

Учебно-исследовательская работа

Методика изготовления               постоянных микропрепаратов

Цитология

                                         Выполнила: Михеева Алена

                                  обучающаяся 11 класса

                                                       Руководитель:

                                                       Ялбакова Т.А..- учитель биологии

2023  г.

Содержание:  

Введение…………………………………………………..с.3

I.Литературный обзор.

   I.1. Общие сведения о   микроскопии……………с.4

   I.2. Хранение и микроскопирование  ……………………….с.5

     I.3. ……………………………………с.6

II.Исследовательская часть.

          II.1. …………………………с.9

          II.2. ………….с.9

          II.3. …………………..с.11

III.Выводы………………………………………………………….с.12

IV.Литература………………………………………………………с13

V.Приложение 1. ……………….с.14

Введение

              В науке биологии открыто много методов, например, в физиологии: аналитическое наблюдение, поведенческие методы, морфологические, физиологические, химические, биохимические, методы окрашивания тканей и клеток, микроскопирование, метод механики, электрической

регистрации,МЭГ, электромиографии, радиографии, метод сканирования и др.

              Микропрепараты. Они позволяют демонстрировать внутреннее клеточное строение организмов, что помогает формированию у учащихся знаний о едином клеточном строении организмов. Микропрепараты можно разделить на две группы: постоянные, выпускаемые промышленностью, и временные, изготовляемые во время занятий для однократного пользования.

Постоянные микропрепараты представляют собой микроорганизмы, срезы растительных и животных тканей. Для лучшего различения отдельных микроструктур микропрепараты окрашивают специальными красителями. Используют их при изучении нового материала, обобщениях, сопоставлениях и опросе. Преподаватель до работы с микропрепаратом должен четко объяснить учащимся, что они должны увидеть, используя таблицы, рисунки, схемы и т. п.      

      Во время опроса преподаватели нередко используют «немые», (без этикеток) микропрепараты. Учащимся дается задание определить микропрепараты, рассказать о строении той или иной ткани. Целесообразно хранить одинаковые микропрепараты в одной упаковке, чтобы можно было быстро раздать их учащимся.

Микропрепараты хранят вдали от отопительных приборов и так, чтобы предметное стекло находилось в горизонтальном положении для предотвращения «сползания» микропрепарата.

Цели:

Задачи:

- ознакомиться с методом экспериментальных исследований в области цитологии растений;

-  развить умение наблюдать, делать  опыты,  

-развить умения самостоятельно работать с исследуемым материалом, различными источниками информации, решать практические задачи,

Изобретение и усовершенствование микроскопа.

       К микроскопам в современном понимании относится лишь "сложный" микроскоп — прибор, состоящий из двух систем линз: окуляра и объектива. Но на заре микроскопии широко использовались и "простые" микроскопы, которые сегодня мы назвали бы лупой.

Один из первых сложных микроскопов был сконструирован в 1609-1610 гг. Галилеем как видоизмененный телескоп. Современный сложный микроскоп ведет свое происхождение от английских или голландских двухлинзовых микроскопов начала XVII в. Объекты в них рассматривались при дневном освещении в падающем свете; приспособления для наведения на фокус отсутствовали.

Первое крупное усовершен-ствование сложного микроскопа связано с именем английского физика Роберта Гука (1635-1703). Улучшения затронули как оптику, так и особенности механической конструкции. Принципиально новой явилась и придуманная ученым система искусственного освещения объекта.

    Развитие микроскопии в XVIII столетии шло главным образом по пути улучшения конструкции механических частей. Тубус, несущий линзы, укреплялся теперь подвижно на особой колонке, его передвижение обеспечивалось специальным винтом с нарезкой. Усовершенствования конструкции позволяли теперь исследовать как прозрачные объекты в проходящем свете, так и непрозрачные в падающем. С 1715 г. у микроскопа появляется привычное нам зеркало.

Во всех сложных микроскопах XVII — XVIII вв. при увеличениях выше 120 — 150 раз  сильно искажали изображение. Поэтому становится понятным то предпочтение, которое микроскописты того времени, начиная с А. Левенгука, отдавали простому однолинзовому микроскопу. Проблема хроматической аберрации была решена в конце XVIII — начале XIX в. за счет применения комбинации линз из разных сортов стекла. Первый ахроматический микроскоп был сконструирован в 1784 г. петербургским академиком Ф. Эпинусом, но в силу ряда причин широкого распространения он не получил. Дальнейшие шаги на пути ахроматизации микроскопа были предприняты одновременно разными мастерами в Германии, Англии и Франции. В 1827 г. Дж. Б. Амичи использовал в объективе плоскую фронтальную линзу, что позволило уменьшить сферическую аберрацию.

       Техника шлифовки и взаимной подгонки линз достигла такого совершенства, что микроскопы первой половины XIX в. могли давать увеличение до 1000 раз. Практическое применение таких сильных систем ограничивалось тем, что поле зрения при больших увеличениях оставалось темным — значительная часть лучей, преломляясь в воздухе, не попадала в объектив. Коренное улучшение было достигнуто с началом применения [иммерсии]. Масляный иммерсионный объектив был создан конструкторами фирмы К. Цейса.

Создание фабричного производства микроскопов, соревнование между конкурирующими фабриками привело к удешевлению инструментов, и в сороковых годах XIX столетия микроскоп становится повседневным лабораторным инструментом, который могли иметь даже отдельные врачи и студенты.

В 1886 г. фирма К. Цейса выпустила новые объективы-апохроматы, где коррекция сферической и хроматической аберрации была доведена до предела. Как показали вычисления Э. Аббе, с изготовлением этих линз был достигнут предел разрешающей способности светового микроскопа.

           Параллельно с совершенствованием микроскопа развивалась методика приготовления микроскопических препаратов. Долгое время она оставалась весьма примитивной — до начала XIX в. микроскописты в основном рассматривали высушенные объекты. Исследуются свежие препараты, не подвергнутые какой-либо обработке. Методов изготовления "постоянных препаратов", чем характеризуется современная микроскопия, еще не существовало, из-за этого исследователь лишался возможности длительного изучения препарата и сравнения новых препаратов со старыми.

        К началу второй четверти XIX в. исследователи стали применять для изучения тканей некоторые реактивы, например, прибавление уксусной кислоты давало возможность выявления клеточных ядер. Реактивы применялись тут же, на предметном столике микроскопа.

             С 80-х гг. XIX в. в практике микроскопических исследований непременным атрибутом становится микротом, изобретенный Я. Пуркинье. Применение микротома дало возможность изготавливать тонкие срезы и получать непрерывные серии срезов, что привело к успехам в изучении тонкого строения клетки.

        В середине XIX в. микроскописты начинают использовать различные методы фиксации и окраски препаратов, заливки исследуемых объектов в более плотные среды. С 70-х гг. XIX в. для изготовления постоянных препаратов начинают традиционно применять канадский бальзам.

       Пропорции изготовления глицерин-желатина, последовательность смешения. Этапы изготовления постоянных препаратов, не требующих осветления. Методика отпрепаровки частей беспозвоночных. Критерии к объектам для определения допустимости их заключения в глицерин-желатин.

О.Г. БАРИНОВ

Изготовление постоянных микропрепаратов

 Работаю биологом в школе уже несколько лет. Пользуюсь в основном наследством, оставшимся от застойных времен, которые все так дружно ругали... Я не жалуюсь, в школе даже микроскопы сохранились... Но как ни стараемся мы, микропрепараты нет-нет, да и бьются или давятся неопытными руками. Когда возможно, делаем временные, но это требует, простите за невольный каламбур, времени, которого на наш предмет и так не много. Может, подскажете какой-нибудь способ изготовления постоянных препаратов на основе подручных материалов? Ни о канадском, ни о пихтовом бальзаме я не заикаюсь...» 

    Перед учителями биологии и руководителями кружков рано или поздно встает задача изготовить учебный микропрепарат. Нам хотелось подобрать вещество, способное надолго зафиксировать биологический объект, сделать эту процедуру простой и доступной. Известные бальзамы (смолы-фиксаторы) никогда не относились к легкодоступным веществам, особенно в удалении от крупных городов. Кроме того - вещества эти не безвредны.  

Для склеивания  можно пользоваться клеем ПВА (поливинилацетатным), поскольку его капли образуют прозрачную, долго сохраняющую эластичность пленку, а главное – не портят бумагу, в отличие, например, от силикатного клея.

Как мы позже опытным путем выяснили, этим клеем ПВА можно успешно пользоваться как заменителем лака.  После застывания клей, видимо, полимеризуется и даже приобретает изрядную водостойкость. Случайные брызги воды работам с таким покрытием не страшны.

Использовать клей ПВА для изготовления препарата.  Важно, чтобы препарат был влажный, хорошо смоченный, а клей – свежий и чуть разбавленный чистой холодной кипяченой водой до нужной концентрации (клей представляет собою эмульсию и легко разводится). После нескольких проб и ошибок нужную концентрацию вы сможете составлять и определять без труда.

Дальше все просто. На чистое предметное стекло нанесите каплю воды – кипяченой или, если вы дружите с учителем химии, дистиллированной. Воду надо аккуратно удалить чистой, не оставляющей волосков тканью или фильтровальной бумагой так, чтобы стекло было чуть влажным. Это, как и влажность образца, способствует равномерному (без пузырьков) смачиванию. На подготовленную поверхность нужно нанести небольшую каплю заранее приготовленного клея ПВА так, чтобы не появились пузырьки воздуха. Они иногда и не мешают, но внешний вид препарата портят. В эту каплю аккуратно переносят заранее подготовленный срез или образец, например, предварительно умерщвленную горячей водой дафнию (умерщвление преследует сразу две цели – я не хочу воспитывать в детях бесцельную жестокость, с другой стороны – неподвижное животное при наличии элементарных навыков работы с препаровальной иглой можно расположить в капле клея так, чтобы впоследствии его было удобно рассматривать). Затем плавным наклонным движением (сначала капли касается один край стекла, как при изготовлении временного препарата) надо сверху положить покровное стекло, также чистое и слегка влажное. Слой клея между стеклами должен быть как можно более тонким.

Если что-то не удалось, а образец ценный и достаточно крупный, почти всегда, в отличие от смол, есть возможность его отмыть простой водой и процедуру повторить. Излишки клея аккуратно смываются тонкой струйкой воды; нужно следить, чтобы она не затекала между стеклами. Покровное стекло необходимо придерживать. Чуть мутноватые остатки воды можно аккуратно удалить фильтровальной бумагой, а лучше – полоской тонкой ткани без ворса (если ее сразу тщательно сполоснуть, ткань можно использовать многократно – клей, пока не высох, отстирывается начисто).

Готовые препараты надо разложить в теплом сухом месте. Индикатором готовности препарата служит его прозрачность. В зависимости от очень многих факторов высыхание до прозрачного состояния продолжается от одной до четырех недель. Бывает, что слишком толстый слой клея или клей, загрязненный примесями, полностью прозрачным не становится – это несколько ухудшает изображение, но благодаря небольшой глубине резкости микроскопа даже такие препараты доступны для изучения.

   Технология изготовления временных препаратов по общей ботанике.

1.Моют и тщательно протирают предметное и покровные стёкла. Чтобы не сломать очень хрупкое покровное стекло, его споласкивают в воде, помещают в складку полотенца между большим и указательным пальцами правой руки и осторожно вытирают круговыми движениями пальцев.

2. Наносят на предметное стекло каплю жидкости (воды, глицерина, раствора реактива или красителя ).

3. Делают срез изучаемого органа при помощи бритвы.

4. Выбрав самый тонкий срез, кладут его на предметное стекло в каплю жидкости.

5. Закрывают срез покровным стеклом так, чтобы под него не попал воздух. Для этого покровное стекло берут двумя пальцами за грани, подводят нижнюю грань к краю капли жидкости и плавно опускают.

6. Если жидкости много и она вытекает из-под покровного стекла, удаляют избыток её кусочком фильтровальной бумаги. Если же под покровным стеклом остались места, заполненные воздухом, добавляют жидкость, поместив каплю её рядом с краем покровного стекла.

Технология изготовления постоянных микропрепаратов по общей ботанике.

1.Фиксация и хранение материалов. Сущность фиксации заключается в быстром умерщвлении клеток и тканей, при котором сохраняется их прижизненная структура, а все коллоиды клеток переводятся в нерастворимое состояние и приобретают способность воспринимать красители. Фиксацию осуществляют путём погружения материала в различные ядовитые жидкости или в крепкий спирт. Материал, заготавливаемый для гистологических исследований, обычно фиксируется 96 градусным этиловым спиртом и оставляют в нём на хранение. Однако для фиксации сильноодревесневших органов растений лучше взять 80 процентный спирт и через несколько дней добавить в банки с материалом крепкого глицерина (до 1/3 от объёма спирта). Материал для эмбриологических исследований (бутоны цветков, пыльники), а иногда и для гистологических лучше фиксировать специальными жидкостями (например, уксусным алкоголем или фиксатором Чемберлена). По истечении срока фиксации такой материал следует промыть тремя сменами 80процентного спирта и хранить в последнем. Если срезы изготавливают из живого материала, то для лучшей окраски красителями их необходимо зафиксировать спиртом. Органы растений и небольшие растения, которые предполагают использовать для демонстрации, следует фиксировать 4процентным раствором формалина и хранить в 2процентном растворе формалина или в смеси 2процентного формалина со спиртом любой концентрации.

2. Изготовление срезов. Для простейших препаратов достаточно тонкие срезы делают при помощи острой бритвы. Для получения срезов определённой толщины используют специальные приборы, называемые микротомами.                                                                                                            3. Окрашивание срезов. Наиболее тонкие срезы переносят в чистое часовое стекло, в которое наливают при помощи пипетки небольшое количество водного раствора красителя. Через несколько минут (это зависит от концентрации красителя) краситель удаляют и срезы несколько раз промывают водой или 50процентным спиртом до полного удаления лишней краски (желателен контроль под микроскопом). Окрашивают срезы или одним красителем , или применяют комбинированное окрашивание двумя или даже тремя красителями. Двойную окраску гематоксилином и сафранином производят следующим образом: срезы помещают в раствор гематоксилина Делафильда. Через несколько минут срезы промывают водой, а затем 50процентным спиртом. Далее переносят их в 1%-ный спиртовой раствор сафранина на 10-20 минут. Окраску сафранином производят при подогревании. Избыток сафранина удаляют путём промывки 50процентным спиртом. Клетчатка окрасится в сине-фиолетовый цвет, а древесина – в красный. Для лучшего окрашивания срезов надо сначала перенести их на несколько минут в разбавленную жавелевую воду, промыть водой, а затем уже помещать в раствор красителя.

4. Заключение срезов в глицерин-желатину.  Окрашенные и промытые срезы переносят по одному на предметные стёкла в заранее подготовленные капли расплавленной глицерин - желатины. Удобно брать срезы и переносить их при помощи миниатюрной деревянной лопаточки, которую можно легко изготовить, зачистив ножом второй конец кисточки или деревянную палочку. В процессе работы следует подогревать предметные стёкла с каплями глицерин - желатины настольной электрической лампой или на чашке с горячей водой, закрытой большим стеклом. Другую каплю глицерин - желатины наносят на чистое покровное стекло и аккуратно накрывают им срез. При этом под покровным стеклом не должно быть пузырьков воздуха. Избыток глицерин - желатины, выступивший из-под покровного стекла, удаляют кусочком фильтровальной бумаги. После застывания среды препарат готов. Рекомендуется подчистить края покровного стекла и окантовать лаком, олифой или нитроэмалевой кр

5.Заключение срезов в канадский бальзам. Перед заключением  окрашенных срезов в канадский бальзам их нужно обезводить спиртом и пропитать растворителем бальзама – ксилолом. Все необходимые операции со срезами производят в одном или нескольких часовых стёклах, применяя пипетки и деревянные лопаточки. В часовом стекле с окрашенными срезами сначала  заменяют  воду на  96процентный спирт. Для лучшего обезвоживания спирт меняют 2 – 3раза. Затем 96процентный спирт заменяют абсолютным, абсолютный спирт – карбоксилолом, а последний – чистым ксилолом. Производят 2 – 3 смены ксилола. Из ксилола при помощи деревянной лопаточки один или несколько срезов переносят на чистое предметное стекло, наносят каплю канадского бальзама и накрывают чистым покровным стеклом. Рекомендуют и на покровное стекло нанести небольшую каплю бальзама, что будет препятствовать появлению пузырьков воздуха под ним. Избыток канадского бальзама удаляют при помощи фильтровальной бумаги. После высыхания бальзама препарат готов для исследований.

Практическая часть

Список литературы:

 -“Методика проведения опытов и наблюдений по анатомии, физиологии, гигиене человека” – Л. Г. Воронин, Р. Д. Маш. Представлены различные методы анатомии; микроскопирование, соматоскопия, проекций, сравнительно – анатомические, метод условных рефлексов, инструментальные, окрашивание, функциональная проба, метод лабораторного исследования, физиологических и клинических наблюдений, метод санитарного описания и

др.