Каталитическая активность ферментов

Введение

Все химические процессы, протекающие в живых организмах,

контролируются ферментами. Поэтому они играют важнейшую роль в

жизнедеятельности всех живых существ на планете, а в особенности

человека.

    Значительные достижения последних лет в области молекулярной

биологии и генной инженерии во многом связаны с успешным

использованием ферментов. С их помощью получают продукты питания,

одежду, лекарственные препараты и сложные химические соединения.

    В медицине ферменты используют для лечения и диагностики различных

заболеваний.  Но наука не стоит на месте и в настоящее время ферментам

находят все большее применение в различных сферах деятельности

человека, поэтому мы можем с полной уверенностью полагать, что

выбранная нами тема сейчас является интересной и актуальнойДля исследования или практического работника, занимающегося ферментами, определение активности ферментов - это постоянная, повседневная работа, потому что любое изучение свойств ферментов, любое применение их в практической деятельности- в медицине и в народном хозяйстве- всегда связано с необходимостью знать, с какой скоростью протекает ферментативная реакция. Что бы понять и правильно оценить результаты определения ферментативной активности, нужно совершенно отчётливо представить себе, от каких факторов зависит скорость реакции, какие условия оказывают на неё влияние

Цель. Комплексное изучение биохимической природы ферментов, ферментативная активность белков.

Задачи.

•  Развить знания учащихся о свойствах и значении ферментов;
•  раскрыть  сущность механизма действия ферментов;
•  реализовать межпредметные связи;
•  развить познавательный интерес путем выполнения  лабораторного опыта.
•  

Постановка целей и задач.

Работа с литературой по данной теме.

Прогнозирование результатов.

Выполнение опытов.

Объяснение результатов опытов.

Изменение условий проведения опытов.

Выводы.

Основная часть

Катала́за -гемсодержащий фермент класса оксидоредуктаз, катализирующий разложение перекиси водорода с образованием кислорода и воды; широко распространена в тканях животных и растений.

Н₂О₂ + Н₂О₂ = О₂ + 2Н₂О.

Каталаза представляет собой гемопротеин, простетической группой которого является гем, содержащий ион трехвалентного железа. Молекула каталзы состоит из четырех, по-видимому, идентичных субъединиц с молекулярной массой 60 000 и имеет соответственно четыре простетические группы. Феррипротопорфириновые группы гема прочно связаны с белковой частью фермента — апофермектом и не отделяются от него при диализе. Оптимальная величина рН для каталазы находится в интервале значений 6,0—8,0.

Процесс окисления с помощью цитохромов дает побочный продукт, в больших концентрациях губительный для всего живого,— перекись водорода. Совершенно ясно, что организм нужно защитить от этого крайне опасного соединения. Такая защита есть. Это фермент каталаза. Биологическая роль каталазы заключается в деградации перекиси водорода, образующейся в клетках в результате действия ряда флавопротеиновых оксидаз (ксантиноксидазы, глюкозооксидазы, моноаминоксидазы и др.), и обеспечении эффективной защиты клеточных структур от разрушения под действием перекиси водорода. Каталаза широко распространена в тканях животных, в т.ч. человека, растений и в микроорганизмах (однако фермент полностью отсутствует у некоторых анаэробных микроорганизмов). В клетках каталаза локализуется в специальных органеллах — пероксисомах.

Открытие каталазы также связано с перекисью водорода. Еще Луи Тенар, который, как мы знаем, занимался каталитическим разложением аммиака, открыл перекись водорода в 1818 году и заметил каталитическую активность по отношению к этому веществу животных тканей. Но только в 1907 году было установлено, что в этом повинен фермент, который и назвали каталазой. В кристаллическом виде получить ее удалось только через 30 лет из печени быка. Это один из наиболее активных ферментов, молекула которого разлагает в секунду 6 миллионов молекул перекиси водорода. Но что интересно, когда концентрация перекиси водорода становится незначительной, каталаза начинает катализировать реакцию окисления перекисью водорода спиртов, формальдегидов и нитратов. Ферменту простаивать нельзя!

Есть еще один фермент, содержащий железо, который также катализирует реакцию разложения перекиси водорода, это пероксидаза, открытая в самом начале нашего века. Она содержится в слюне, в соке поджелудочной железы, в печени, почках и в лейкоцитах. Имеются сведения, что в плазме крови присутствует особая пероксидаза, которая способствует реакциям некоторых производных перекиси водорода. Особенно богаты пероксидазой сок фигового дерева и корень хрена. И вообще следует заметить, что этот фермент широко распространен в живой природе.

С каталазой и пероксидазой связывают надежды на получение высокоэффективных препаратов для лечения злокачественных опухолей, так как полагают, что эти ферменты играют важную роль в росте клеток.

Методы определения активности каталазы.

Газометрический способ определения активности каталазы по Варбургу и его модификации. Сущность этого способа заключается в улавливании и измерении объема выделившегося кислорода после прибавления к водному раствору перекиси водорода экстракта каталазы [1]. Для определения активности каталазы пользуются прибором (рис. 5), который состоит из каталазника 1, бюретки 5 на 50 мл и стеклянной груши 4 или второй бюретки, соединенных каучуковыми трубками и стеклянным тройником 2. Каучуковая трубка на свободном конце тройника снабжена зажимом 3. В штативе закреплена бюретка и стеклянная груша 4. Их заполняют дистиллированной водой до половины объема.

 рис. 4 прибор для определения активности каталазы

Растительную навеску (листья, почки, плоды и другие органы растения) массой 0,5-1 г растирают в фарфоровой ступке с кварцевым песком и добавляют 0,5 г мела для создания щелочной среды (рН > 7,7) для оптимальной активности каталазы. Во время растирания вливают небольшими порциями 20 мл воды, смесь вносят в одно колено каталазника. В другое колено помещают 5 мл 3 %-ного раствора перекиси водорода. Каталазник соединяют с каучуковой трубкой, не допуская смешивания жидкостей.

Открывают зажим и перемещением груши 4 вверх устанавливают уровень воды в бюретке на нуль. Закрывают зажим и быстрым изменением положения каталазника смешивают жидкость в обоих коленах. Затем, все время, потряхивая каталазник, по снижению уровня воды в бюретке 5 отмечают объем кислорода (в мл), выделенного в течение 3 мин.

Во время опыта каталазник нужно держать двумя пальцами в области пробки, чтобы не происходило его нагревание, так как последнее может повлиять на точность эксперимента.

Недостатками этого способа являются необходимость расчета и учета постоянного объема сосуда, зависимость от внешних условий (температуры, высоты местности над уровнем моря и атмосферным давлением), необходимость в приспособлении для механического взбалтывания прибора и по возможности исключения прикосновения руками к колбе или склянке.

Титрометрический способ определения активности каталазы по А. Н.Баху и А.И.Опарину, основанный на учете неразложившейся перекиси водорода с помощью перманганата калия, который был выбран нами в качестве прототипа. Сущность его заключается в следующем. Берут навеску пробы 1-2 г и растирают с кварцевым песком в ступке, добавляя постепенно 2-3 мл воды. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике шпателя карбонат кальция до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу и доводят водой до 100 мл. Смесь оставляют стоять в течение 30-60 мин, после чего ее фильтруют. В коническую колбу на 200 мл берут пипеткой 25 мл 0,1 н. раствора пероксида водорода и добавляют туда же пипеткой 20 мл вытяжки фермента. Через 30 мин действие фермента прекращают прибавлением 5 мл 10%-ного раствора серной кислоты и титруют смесь 0,1 н. раствором перманганата калия (до образования устойчивого в течение 1 мин розового окрашивания). Одновременно ставят контроль с инактивированным нагреванием в кипящей бане в течение 5 мин ферментным раствором (20 мл). К этому раствору после охлаждения добавляют 25 мл 0,1 н. раствора Н₂О₂. Смесь оставляют стоять на 30 мин, после чего добавляют 5 мл 10% -ного раствора серной кислоты и титруют 0,1 н. раствором перманганата калия. Отмечают количество миллилитров перманганата калия, израсходованного на титрование всего количества пероксида водорода. По разнице между опытным и контрольным титрованиями находят количество перманганата, эквивалентное количеству разложенного ферментов пероксида водорода.
Расчет количества пероксида водорода, разложенного ферментом, ведут, исходя из того, что 1 мл 0,1 н. раствора перманганата калия соответствует 1,7 мл пероксида водорода [3].
Недостатками способа являются получение субъективных результатов в процессе титрации, необходимость постоянной проверки титра перманганата калия щавелевокислым аммонием, необходимость ежедневной проверки титра пероксида водорода, сложность расчета.

Электрофорез. Выявления каталазной активности в биологических объектах, основанный на формировании в качестве поддерживающей среды для электрофореза полиакриламидного геля (ПААГ) с использованием крахмала, проведении электрофореза и последующего окрашивания геля иодистым калием. Отличие способа состоит в том, что крахмал вводят в количестве, не превышающем 0,5 мас.%, на стадии подготовки раствора надсернокислого аммония при приготовлении разделяющего геля, а окрашивание осуществляют обработкой в 1%-ном растворе перекиси водорода рН 7,0 с последующей инкубацией в 1%-ном растворе уксусной кислоты, при этом время выдерживания в каждом из этих растворов составляет 3-10 мин [2].
Недостатками способа является наличие оборудования для проведения электрофореза, необходимость в соответствующих реактивах для приготовления ПААГ, длительность проведения анализа.

Окрашивание пробы. Определения активности каталазы в биологических объектах путем окрашивания пробы раствором, содержащим йодистый калий, с последующим анализом, пробу биологического материала обрабатывают перекисью водорода и смесью (ацетона и йодистого калия в отношении 1:1), причем анализ проводят путем фотоколориметрирования пробы на ФЭК - 56 М при длине волны 435-445 нм, а активность каталазы определяют по формуле
A=D:0,02, где A - активность каталазы в пробе;
D - оптическая плотность исследуемой пробы;
0,02 - коэффициент перевода в условные единицы активности (Е).

Газометрический метод Лишкевича –

наиболее простой способ определения активности каталазы.

5 штук не проросших семян с небольшим объемом песка растирают в фарфоровой ступке, прибавляют 3 мл дистиллированной воды, перемеши­вают и выливают в колбочку прибора Лишкевича. Двумя миллилитрами воды ополаскивают ступку и жидкость выливают в колбочку прибора. До­бавляется на кончике совочка мел. В тигелек наливают 2 мл 2%-ной пере­киси водорода, нейтрализованной 3 каплями 0,1 н NaOH. Тигелек при по­мощи пинцета устанавливают на дно колбочки. Колбочку плотно закрыва­ют пробкой, которая резиновой трубкой через тройник соединяется с уравнительным сосудом.

Через отверстие в уравнительном сосуде наливают воду до нулевого деления бюретки и выходное отверстие каучуковой трубки тройника за­крывают зажимом. Далее обязательно проверяют прибор на герметичность. Для этого уравнительный сосуд опускают вниз и фиксируют в одном по­ложении. Уровень воды в бюретке также должен быть в одном положении. В противном случае устраняют неисправность.

Держа мениски воды нулевого деления бюретки и уравнительного сосуда на одном уровне, опрокидывают тигелек с перекисью водорода в колбочку и в течение 4 минут легонько встряхивают колбочку. Выделяю­щийся кислород вытесняет из бюретки воду, уровень которой по мере уве­личения количества газа начинает опускаться.

Количество выделившегося кислорода отмечают каждую минуту, причем в момент отсчета уровень воды в уравнительном сосуде устанавли­вают точно по уровню в бюретке. Опыт повторяют 2 раза, высчитывают среднее арифметическое.

Активность каталазы выражается величиной, равной объему воды, вытесненной кислородом за 5 минут.

Практическая часть:

Исследовательская работа №1.
Определение наличия каталазы в живых тканях

Вывод:В тканях и клетках живых организмов присутствуют специальные белки, выполняющие роль биологических катализаторов – ферментов.

В тканях и клетках, подвергнутых термической обработке, белки денатурировали, разрушилась их структура.

Исследовательская работа №2.
Определение наличия каталазы в живых тканях

Вывод

Каталаза – фермент, катализирующий разложение пероксида водорода

(побочного токсичного продукта метаболизма в клетках животных и растений). В ходелабораторного опыта, мы убедились, что каталаза функционирует только в живых тканях и при температуре от 40ºС до 60ºС. В тканях подвергнутых термическойобработке фермент денатурировался поэтому реакции не происходит.

Исследовательская работа №3.
Ферментативный гидролиз крахмала