«ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕГЕНЕРАЦИИ В МИКРОКЛОНАЛЬНОМ РАЗМНОЖЕНИИ РАСТЕНИЙ»

 МУНИЦИПАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ «ГИМНАЗИЯ №3»  г. Брянск

Проектно-исследовательская работа

«ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕГЕНЕРАЦИИ

В  МИКРОКЛОНАЛЬНОМ РАЗМНОЖЕНИИ РАСТЕНИЙ»

для участия в Шестой научно-практической конференции проектных и исследовательских работ учащихся медико-биологических классов

школ-партнеров Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Предметная область - биология

Авторы: учащиеся МБОУ «Гимназия №3»

г. Брянска

                                                       Козявина Кристина Юрьевна

 Раковский Александр Александрович

Калошина Алёна Александровна

Руководитель: Бабич Елена Викторовна

e-mail: alenababich020578@yandex.ru

                                              Должность: учитель биологии

г. Брянск

2013

Содержание

1. Введение………………………………………………………………….….3
2. Гипотеза, цель и задачи исследования…………………………………….3
3. Объект и методы исследования……………………………………........…3
4. Обзор литературы по выбранной теме

1.  Регенерация и микроклональное размножение растений………...4
2.  Этапы и методы микроклонального размножения       растений………………………………………………………………6

5. Практическая часть

5.1 Приготовление питательной среды для культивирования               изолированных органов, тканей и клеток растений……………..........7

6. Заключение…………………………………………………………………...9

7. Список литературы…………………………………………..………............9

8. Приложение………………………………………………………………...10

1. Введение

Биотехнология – наука о методах и технологиях создания и использования генетических трансформированных биологических объектов. Один из методов биотехнологии – это микроклональное размножение (клеточная биотехнология), основанное на способности клеток и тканей к регенерации, что обеспечивает ускоренное получение ценных форм и линий сельскохозяйственных растений. Оно не зависит  от сезона, позволяет получать оздоровленный посадочный материал от вирусной и бактериальной инфекции, дает возможность выращивать сотни тысяч растений из одной меристемы, размножать ценные генотипы, получать биологические препараты пищевого, кормового и медицинского направления.  

2. Гипотеза, цель и задачи исследования

Гипотеза: в основе микроклонального размножения земляники лежит способность изолированных частей растений восстанавливать недостающие органы и регенерировать целые растения.

Цель работы: доказать, что в основе микроклонального размножения земляники лежит способность растений к регенерации

Задачи работы: изучить метод микроклонального размножения растений и его значение по литературным источникам; овладеть технологией приготовления питательных сред для культивирования изолированных органов и тканей; провести микроклональное размножение растений на основе их способности к регенерации; сделать выводы о проделанном исследовании.

3. Объект и методы исследования

Объект исследования: меристематические верхушки растений земляники.

Методы исследования: метод индукции адвентивных почек тканей эксплантата; наблюдение; экспериментальный метод.                                            

Работа выполнялась в лаборатории Брянской Сельскохозяйственной Академии под руководством заведующего лабораторией биотехнологии Сковородникова Дмитрия Николаевича.

4. Обзор литературы по выбранной теме

В ходе работы были изучены публикации отечественных авторов по сельскохозяйственной биотехнологии, биотехнология сельскохозяйствен-ных растений, а так же методическое пособие по биотехнологии.

4.1. Регенерация и микроклональное размножение растений

Регенерация — способность живых организмов восстанавливать повреждённые ткани, целые органы. Значение регенерации заключается в том, что на основе клеточного и внутриклеточного обновления органов обеспечивает восстановление и компенсация функций, нарушенных в результате различных патогенных факторов.

Широкое распространение регенерации в царстве растений обусловлено сохранением у них меристем (тканей, состоящих из делящихся клеток) и недифференцированных тканей. На кончике нормального стебля имеется верхушечная почка (адвентивная), обеспечивающая непрерывное образование новых листьев и рост стебля в длину в течение всей жизни данного растения. Если отрезать эту почку и поддерживать ее во влажном состоянии, то из имеющихся в ней паренхимных клеток или из каллуса, образующегося на поверхности среза, часто развиваются новые корни, почка при этом продолжает расти и дает начало новому растению [4].

В природе существует два способа размножения растений: семенной и вегетативный. К особенностям семенного размножения следует отнести генетическую пестроту получаемого посадочного материала и длительность вегетационного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность вегетационного периода.

Достижения с области культуры клеток и тканей привели к созданию нового метода вегетативного размножения – микроклонального размножения (получение в условиях in vitro (в пробирке), неполовым путём растений, генетически идентичны исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки давать начало целому растительному организму и регенерации. Первые исследования начались в конце 50-х годов 20 века, нашей стране работы проводились в лаборатории культуры тканей и морфогенеза Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева.  Этот метод имеет ряд преимуществ:

1. Получение генетически однородного посадочного материала;
2. Освобождение растений от вирусов;
3. Высокий коэффициент размножения;
4. Сокращение продолжительности селекционного процесса;
5. Ускорение перехода растений от ювенальной к репродуктивной фазе развития;
6. Получение растений, трудноразмножаемых традиционными способами;
7. Возможность проведения работ в течение круглого года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочных материалов;
8. Возможность автоматизировать процесс выращивания.

Область применения микроразмножения разнообразна и имеет тенденцию к постоянному расширению:

1. Размножение взрослых древесных пород (каштан, дуб, клён, осина);
2. Сохранение редких и исчезающих лекарственных видов растений;
3. Получение вторичных метаболитов, используемых для производства лекарств (алкалоидов, глюкозидов, стероидов), вкусовых добавок (сахаров); гормонов, витаминов, белков;
4. Использование культурных клеток в качестве источника новых химических веществ;
5. Размножение и промышленное производство плодоовощных и декоративных растений [3].

Таким образом, клеточная биотехнология, основанная на способности клеток и тканей к регенерации,  позволяет человеку решать многие актуальные вопросы селекции, связанные с проблемой растущего населения Земли.

4.2. Этапы и методы микроклонального размножения растений

Процесс микроклонального размножения можно разделить на 4 этапа: 1. Выбор растения-донора и получение хорошо растущей стерильной культуры;

    2. Собственно микроразмножение, когда достигается максимальное количество микропобегов;

    3. Ускорение развития размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям;

    4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации и посадке в поле [3].

Изучив предложенные в литературе методы микроразмножения растений, мы выбрали метод, используемый в биотехнологической лаборатории Брянской Государственной Сельскохозяйственной Академии - индукции адвентивных почек эксплантата.

        Он основан на способности изолированных частей растений при благоприятных условиях питательной среды, восстанавливать недостающие органы и регенерировать целые растения  из разных частей (изолированного зародыша, листа стебля, семядолей, чешуек сегментов корней и зачатков соцветий) [3].

        Мы проводили микроклональное размножение земляники. При этом изолировали меристематические верхушки этих растений и выращивали их на питательной среде Мурасиге-Скуга. Через 3-4 недели культивирования меристема развивалась в проросток, в основании которого формировались адвентивные почки, которые быстро росли и давали начало новым почкам. В течение 6-8 недель образовались конгломераты почек, связанные между собой соединительной тканью и находящиеся на разной стадии развития. Появились листья на коротких черешках, в нижней части которых сформировались новые адвентивные почки. Это почки мы разделили и, затем пересадили на свежую питательную среду. Таким образом, от одного материнского растения можно получать несколько миллионов растений-регенератов в год. 

                5. Практическая  часть

 5.1 Приготовление питательной среды для культивирования изолированных органов, тканей и клеток растений

Для обеспечения роста и развития любой растительной ткани или органа растения требуется соблюдение внешних физико-химических условий (освещённости, температуры, влажности, кислорода для дыхания, углекислого газа для фотосинтеза), поступление элементов минерального и органического питания. При культивировании растительных эксплантатов в закрытых пробирках фотосинтез затруднён, поэтому требуются более сложные по составу среды, обеспечивающие все потребности тканей или органов [2].  

Культурные среды для растительных эксплантатов содержат следующие группы компонентов:

1. Неорганические макроэлементы в виде солей (N, P, K, S, Fe, Ca, Mg) и микроэлементы (Co, Cu, Zn, B, Mo, Mn, J, Ni);
2. Углеводы – сахароза, глюкоза – основа гетеротрофного питания растений in vitro, обеспечивает рост эксплантата.
3. Аминокислоты, получаемые при гидролизе молочного белка казеина. Они синтезируются in vitro из сахара и минеральных веществ, их добавка оказывает положительное влияние на эксплантаты из меристем.
4. Витамины (В1, В6, С, никотиновая кислота, и  др.) – являются коферментами, обеспечивающих активность, улучшают адаптацию тканей и  их рост.
5. Фитогормоны – стимулируют рост и деление клеток растений, направляет развитее эксплантата в нужную сторону: ауксины – получение корней, цитокинины – побеги, гиббереллин – ростстимурирующий гормон.
6.  Желирующее вещество (агар-агар) регулирует консистенцию среды [2].    

Самой популярной и универсальной минеральной основой для питательных сред является минеральная часть среды Мурасиге-Скуга (МС).

1. Приготовим минеральную среду МС повышенной концентрации.
2. Взяли её 50 мл и развели дистиллированной водой до 500 мл.
3. Добавим 5 мл СаСl2 и перемешаем с помощью магнитной мешалки.
4. Доведём рН до 5,7- 5,8 с помощью раствора HCl.
5. Добавим 25 мг инозита; 3,6 г агар-агар; 15 г сахарозы; по 5 мкл 6% раствора В1; 5% раствора В6; 25мкл никотиновой кислоты и 100 мкл аскорбиновой кислоты.
6. Полученный раствор поместим в микроволновую печь, доведём до кипения и растворения агар-агара.
7. Раствор разделим по 1,5 мл в пробирки и после остывания и отвердения автоклавируем.

На фото в приложении вы можете увидеть результат нашей работы, которая курировалась заведующим лабораторией биотехнологии Брянской Сельскохозяйственной Академии (Брянская обл., Выгоничский р-н, с. Кокино, ул. Советская 2а) Сковородниковым Д.Н.

Мы выражаем благодарность Дмитрию Николаевичу и сотрудникам лаборатории за помощь при выполнении работы.

                                                 6.Заключение

При изучения одного из методов микроклонального размножения мы убедились в том, что растение способно регенерировать и восстанавливать недостающие органы.

Мы овладели технологией приготовления пит. сред и выяснили, что полученные растения устойчивы к болезням, так же есть возможность получать генетически однородный  посадочный материал с высоким коэффициентом размножения.

Мы можем получить растения, трудноразмножаемые традиционным способом, проводить работы в течение круглого года при это экономить площади и  автоматизировать процесс выращивания.

7. Список литературы

1. Биотехнология сельскохозяйственных растений/ пер. с англ. В. И. Негрука Агропромиздат, 1987  

2. Методическое пособие по биотехнологии для студентов БГСХА/ Сковородкин Д.Н.

3.  Сельскохозяйственная биотехнология/В. С. Шевелуха, С. В. Дегтярев,      Г. М. Артамонов и др. Изд-во МСХА, 1995

4. http://www.nedug.ru/library/регенерация/Регенерация#.Un5wCxy7_sM

8. Приложение

См. папку PRILOZHENIYE

Фотографии 1 – 7.  Приготовление питательной среды Мурасиге- Скуга

Фотографии 8 -  15. Получение растительных эксплантов и восстановление на основе регенерации целого растения