Гидролиз нуклеотидов

ГИДРОЛИЗ НУКЛЕОПРОТЕИДОВ ДРОЖЖЕЙ

Кислотный гидролиз используется для изучения химического состава нуклеопротеидов.

СХЕМА ГИДРОЛИЗА НУКЛЕОПРОТЕИДОВ

                                                НУКЛЕОПРОТЕИДЫ (дрожжи)

H2SO4   10%

100oC

               БЕЛОК                                                 НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

(протамины или гистоны)                                                       (ДНК, РНК)

ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ                               

ПОЛИПЕПТИДЫ                                                    ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ

ТРИ-, ДИПЕПТИДЫ

СВОБОДНЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ                            МОНОНУКЛЕОТИДЫ

                                                                   НУКЛЕОЗИДЫ                  ФОСФОРНАЯ

                                                                                                                  КИСЛОТА

                     ПУРИНОВЫЕ                                          ДЕЗОКСИРИБОЗА

         ИЛИ ПИРИМИДИНОВЫЕ                                       ИЛИ РИБОЗА

АЗОТИСТЫЕ ОСНОВАНИЯ

  Продукты гидролиза открывают специфическими реакциями: полипептиды – биуретовой реакцией; пуриновые основания – серебряной пробой (серебряные соли пуринов имеют светло-коричневый осадок), пентозы – пробой Троммера (образуется красное окрашивание вследствие окисления рибозы), фосфорную кислоту – молибденовой пробой (образуется фосфорномолибденовокислый аммоний – желтый кристаллический осадок).

ХОД РАБОТЫ:взять колбу, внести 5 г дрожжей + 40 мл 10%-го раствора H₂SO₄,  закрыть пробкой со стеклянной трубкой и поставить для кипения (100^оС) на 60 минут.

Через час охладить и отфильтровать.В фильтрате открывают продукты гидролиза.

Взять четыре пробирки и в каждой выполнить реакцию:

Выделение рибонуклеопротеида (РНП) из дрожжей

Материалы, реактивы, посуда и приборы:

Пекарские или пивные дрожжи            Орциновый реактив

Диэтиловый эфир                                      Раствор флороглюцина

Песок, промытый и прокаленный           Фелингова жидкость

Ступки                                                        Раствор аммиака (конц.)

Центрифуга                                                1 %-ный раствор AgNO₃

Стакан на 100-200 мл                                Раствор молибдата аммония

                                                                    (NH₄)₂MoO₇

0,4 %-ный раствор NaOH                         Магнезиальная смесь

10 %-ный раствор СН₃СООН                   Колба круглодонная на 100 мл с об-

Лакмусовая бумага                                    ратным воздушным холодильником

2 н раствор NaOH                                      Воронка D= 7 – 8 см

1 %-ный раствор сульфата меди (II)        Стеклянная палочка

Реактив Миллона                                       Пробирка

1 н и 2 н раствор соляной кислоты           Мерный цилиндр на 50 – 100 мл

Ход работы

10 гдрожжей смешать в ступке со смесью 2 мл эфира и 2 мл воды, добавить 5 г речного песка и тщательно растереть, приливая к растертой массе небольшими порциями 40 – 50 мл 0,4 %-ного раствора NaOH. Растирание продолжать 15 – 20 минут, после этого осадок отфильтровать или отделить центрифугированием. Центрифугат слить в стакан и прибавить к нему небольшими количествами (по 0,5 мл) 10 %-ный раствор СН₃СООН до слабокислотной реакции по лакмусу (5 – 6 мл). Полученный осадок нуклеопротеида отделить путем центрифугирования.

Гидролиз нуклеопротеида

Одним из простейших способов разложения РНП является нагревание его в течение 1 часа при 100 ºC в 1 н растворе соляной кислоты. Прежде всего происходит расщепление нуклеопротеидов на белок и нуклеиновую кислоту. Далее белок гидролизуется до аминокислот, но в этих условиях гидролиз белка будет очень незначительным. РНК в этих условиях расщепляется с образованием пиримидиновых нуклеотидов, пуриновые же распадаются до пуринов, рибозы и фосфорной кислоты.

В колбу для гидролиза (с обратным воздушным холодильником) поместить осадок нуклеопротеида и равный ему объем 2 н раствора соляной кислоты и сверх этого еще 20 мл 1 н раствора этой кислоты. Колбу закрыть пробкой с проходящим через нее воздушным холодильником (трубка длиной 70 см и D=0,7 – 0,8 см) и смесь кипятить на плитке с асбестовой сеткой в течение 1 часа, поддерживая только слабое кипение, во избежание улетучивания HCl. Гидролизат отфильтровать и в прозрачном растворе определить наличие белка, пентозы, пуриновых оснований и фосфорной кислоты.

Белок обнаруживается с помощью биуретовой реакции. (Биуретовая реакция с СuSO₄  и NaOH (конц.)).

Пентоза (рибоза)обнаруживается  по реакции с орцином и флороглюцином, либо путем восстановления меди в растворе фелинговой жидкости.

Пуриновые основанияобнаруживаются по их реакции с аммиачным раствором гидроксида серебра. К 2 мл гидролизата прилить по каплям раствор аммиака (конц.) до щелочной реакции по лакмусу и добавить равный объем заранее приготовленного аммиачного раствора гидроксида серебра. Постепенно образуется хлопьевидный осадок серебряных солей пуриновых оснований.

Фосфорная кислотаобнаруживается с помощью молибдата аммония или магнезиальной смеси.

К 2 мл раствора молибдата аммония в азотной кислоте прибавить 1 мл испытуемого раствора. Смесь слегка нагреть. Образуется желто-зеленый осадок состава (NH₄)₃PO₄ · 12MoO₃.

КИСЛОТНЫЙ ГИДРОЛИЗ БЕЛКОВ

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ:Гидролиз белка – это расщепление биополимера с присоединением воды по месту разрыва пептидных связей под действием кислот, оснований или протеаз. Последовательность гидролиза белка показана на схеме.

В лабораторных условиях гидролиз белков используется для определения первичной структуры, аминокислотного состава белков. Гидролизаты белков применяются в качестве лечебных препаратов при парентеральном питании. В организме человека и животных постоянно происходит гидролиз белков в пищеварительном тракте и клетках органов под действием протеолитических ферментов.

ХИМИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ МЕТОДА:Большинство биополимеров в реакциях с водой распадаются на мономеры. Гидролиз катализируют протоны, ионы гидроксила и ферменты по механизму нуклеофильного замещения у углерода с карбонильной группой. Полный кислотный гидролиз белков при кипячении происходит в течение 12-96 часов.

ХОД РАБОТЫ:

1. В химическую колбу внести 20 мл раствора яичного белка.
2. Добавить 5 мл концентрированной НCl
3. Отливают 0,5 – 1 мл смеси в пробирку ( № 1), (5 капель)
4. Колбу закрывают резиновой пробкой с длинной стеклянной трубкой (обратный холодильник)
5. Содержимое колбы кипятить под вытяжкой в течение 45 минут
6. После охлаждения отливают 0,5 – 1 мл гидролизата в пробирку ( № 2) (5 капель)

¯

1. Нейтрализуют содержимое пробирок 20 % NaOH по лакмусу до голубой окраски
2. Проводят биуретовую реакцию в пробирках № 1 и № 2.

РЕЗУЛЬТАТ:

В Ы В О Д:

Исследование состава молока

Цель работы:разделить молоко на составные части и исследовать их

Реактивы:                                                      Оборудование:

Молоко                                                              Колба коническая – 2 шт.

Уксусная кислота                                             Химический стакан на 400 мл

Мел                                                                    Воронка

Азотная кислота (конц.)                                  Фильтровальная бумага

10 %-ный раствор гидроксида натрия            Марля

2 %-ный раствор сульфата меди                     Горелка

Аммиачный раствор гидроксида серебра      Пробирки

[Ag(NH₃)₂]OH

            Молоко содержит сразу три ценных питательных вещества: 1) жир; 2) белок – казеин; 3) углевод – лактозу (восстанавливающий дисахарид, состоящий из двух гексоз – глюкозы и галактозы).

Ход работы

            1. Налейте в колбу 40 мл молока. Для отделения белка прилейте несколько капель уксусной кислоты. При этом казеин сворачивается и образует творожистый осадок (творог).

            2.  Натяните на стакан марлю, сложенную в четыре слоя, и отфильтруйте через нее казеин. Собранный в марле казеин немного отожмите над стаканом и промойте его через марлю струей воды.

            3. Фильтрат в стакане содержит лактозу и уксусную кислоту. Чтобы нейтрализовать кислоту, добавляйте понемногу мел и перемешивайте содержимое стакана до тех пор, пока не перестанет выделяться газ.

            4. Профильтруйте раствор через бумажный фильтр в колбу. Докажите, что фильтрат содержит углевод лактозу (разделите раствор на порции и проведите качественные реакции на карбонильную группу – “серебряное зеркало” – и на гидроксильные группы – с гидроксидом меди (II)).

            5. Поместите немного белка в три пробирки и проведите качественные реакции на белок (нингидриновую, биуретовую, ксантопротеиновую).

            6. Запишите уравнения проделанных реакций.

Сделайте вывод о проделанной работе.

Определение содержания лактозы  цианидным способом

Для определения содержания лактозы в молоке и в молочных продуктах можно использовать метод Бертрана или цианидный метод. Второй метод основан на способности редуцирующих сахаров восстанавливать в щелочном растворе красную кровяную соль К₃[Fe(CN)₆]  в желтую К₄[Fe(CN)₆] при нагревании. Реакция с участием лактозы протекает по схеме:

лактоза  + 2 К₃[Fe(CN)₆]   + 2КОН           лактобионовая кислота + 2 К₄[Fe(CN)₆]   +   Н₂О

       В качестве индикатора используют метиленовую синь, которая в конце реакции восстанавливается лактозой с образованием бесцветного соединения.

Реактивы и оборудование:

1 %-ный раствор гексацианоферрата (III) калия   Мерная колба на 250 мл

20 %-ный раствор сульфата цинка                          Мерный цилиндр на 10 мл

Раствор гидроксида натрия (с = 2,5 моль/л)           Бюретка на 25 мл

0,2 %-ный раствор метиленовой сини                    Капельница

Конические колбы на 100 и 250 мл                         Электроплитка

Воронка с бумажным фильтром                              Водяная баня

Термометр                                                                  Молоко

Дистиллированная вода

1. Приготовление испытуемого раствора лактозы

В мерную колбу на 250 мл с помощью бюретки налить 25 мл молока. Остатки смыть дистиллированной водой объемом не более 150 мл. Колбу поставить на водяную баню при 60 ºС на 15 минут и периодически перемешивать. Затем колбу охладить и для осаждения белков добавить 3 – 4 мл раствора сульфата цинка и 1,5 – 2 мл раствора гидроксида натрия. Смесь встряхнуть, довести объем раствора водой до метки, перемешать, дать осадку отстояться 10 – 15 минут и отфильтровать через складчатый фильтр в сухую колбу. Раствор готов для анализа.

2. Ход определения

            В бюретку налить раствор лактозы. В коническую колбу на 100 мл с помощью мерного цилиндра налить 10 мл раствора К₃[Fe(CN)₆], 2,5 мл щелочи и одну каплю метиленовой сини. Смесь поставить на электроплитку и нагреть до кипения. Поддерживая слабое кипение, смесь оттитровать испытуемым раствором, добавляя его примерно по 1 капле в секунду, до перехода зеленой окраски (через фиолетовую) в светло-желтую.

            При охлаждении раствор приобретает фиолетовую окраску из-за окисления бесцветной формы метиленовой сини кислородом воздуха.

            Массовая доля лактозы в молоке рассчитывается по формуле:

ω= 0,012 · V₁ · 100 %  /V₂    ·  m

где 0,012 – масса лактозы, необходимой для восстановления 10 мл 1 %-ного раствора К₃[Fe(CN)₆], г

V₁ – общий объем испытуемого раствора, равный 250 мл

V₂ – объем испытуемого раствора, пошедшего на титрование 10 мл раствора К₃[Fe(CN)₆]

m – масса молока (25 г)

Пример. На титрование 10 мл раствора К₃[Fe(CN)₆]израсходовано 2,9 мл испытуемого раствора лактозы.

ω= 0,012 · 250 · 100 %  / 2,9   ·  2,5= 4,1%

          Сделайте выводы о содержании лактозы в молоке.

определение содержания крахмала в пищевых продуктах

Реактивы и оборудование:

Мерная колба на 200 мл

Колбы конические на 200 мл с обратным холодильником

Ступки фарфоровые (диаметр 90 мм) с пестиками

Пипетки градуированные на 1, 5, 10 мл

Пипетки Мора на15, 25мл

Бюретка на 25, 50 мл

Стеклянные стаканы на 200 мл

Мерный цилиндр на 100 мл

Предметные стекла

Стеклянная палочка

Электроплитка

Водяная баня

25 %-ный раствор соляной кислоты

10 %-ный раствор хлорида натрия

0,1 н раствор йода в йодиде калия

0,1 н раствор тиосульфата натрия

0,5 н раствор гидроксида натрия

2 н раствор серной кислоты

1 %-ный раствор крахмала

Дистиллированная вода

Крахмалсодержащие продукты (картофель, мука и т.д.)

Ход работы

            По 1 гкрахмалсодержащих продуктов измельчить. В мерные колбы на 200 млцилиндром отмерить по 50 млхолодной дистиллированной воды и перенести туда исследуемый продукт. Быстро влить в колбы по 100 млгорячей дистиллированной воды и сразу же поместить их в кипящую водяную баню на 1 час,чтобы полностью перевести крахмал в раствор. Содержимое колб необходимо периодически перемешивать, при этом крахмальные зерна набухнут и распадутся. Затем колбы вынуть из бани, охладить до 40 ºС. Пипеткой прибавить к содержимому колб 10 млраствора слюны и 5 мл10 %-ного раствора хлорида натрия для активации фермента амилазы слюны.

Для ферментативного гидролиза опустить колбы в водяную баню при 37 – 40 ºС на 1 час. Степень гидролиза крахмала и момент его завершения устанавливается по реакции с йодом. Для этого стеклянной палочкой из колбы достают каплю жидкости с твердыми частицами, переносят пробу на предметное стекло и приливают несколько капель раствора йода в йодиде калия. Исчезновение синего окрашивания при действии йода на пробу свидетельствует об окончании гидролиза крахмала.

Колбу довести водой до метки, тщательно перемешать ее содержимое и отфильтровать в сухой стакан.

Образовавшиеся в результате действия амилазы декстрины и мальтозу гидролизовать 25 %-ной соляной кислотой. Для этого 100 мл фильтрата перенести в коническую колбу на 200 мл.  Добавить 12 мл 25 %-ного раствора  соляной кислоты и выдержать колбу на кипящей водяной бане с обратным холодильником 1 час. По окончании гидролиза коническую колбу охладить, раствор полностью перенести в мерную колбу на 200 мл, довести раствор до метки дистиллированной водой.

В полученном растворе определить содержание глюкозы йодометрией. Для этого в коническую колбу с помощью пипетки поместить 10 мл полученного раствора, 15 мл 0,1 нраствора йода, затем медленно добавить 25 мл0,5 нраствора гидроксида натрия при энергичном помешивании до исчезновения окраски йода. Через 15 минут в колбу прибавить 5 мл2 нраствора серной кислоты и оттитровать выделившийся йод 0,1 нраствором тиосульфата натрия. Когда раствор станет соломенно-желтым, добавить пипеткой 1 мл1 %-ного раствора крахмала на каждые 50 млжидкости.

Параллельно выполняется контрольный опыт, в котором вместо гидролизата берется такой же объем дистиллированной воды. Содержание крахмала (ги %) в продукте рассчитывается по формуле:

C= (V– V₁)  ·  V₂   ·  0,009  ·  0,9 / (a· V₃)

V– объем 0,1 н  раствора тиосульфата натрия, израсходованного на титрование контрольной пробы, мл;

V₁ – объем 0,1 н  раствора тиосульфата натрия, израсходованного на титрование пробы, мл;

V₂ – объем вытяжки из растительного материала, мл (в данном случае 400 мл);

0,009 – коэффициент пересчета результатов титрования на содержание глюкозы; 

0,9 – коэффициент пересчета глюкозы в крахмал;

a– навеска исследуемого материала, г (в данном случае 100г);

V₃– объем гидролизата, взятого для йодометрического определения глюкозы, мл(10мл)

Определение молочной кислоты и мочевины в смывах с кожи рук

Материалы, посуда, реактивы:

Стакан на 50 мл

Пробирки

Водяная баня

Мерный цилиндр

Пипетки на 1 и 2 мл

1 %-ный раствор хлорида железа (III)

Дистиллированная вода

0,5 – 1 %-ный раствор молочной кислоты или сегнетовой соли

1 %-ный спиртовой раствор диметилглиоксима

25 %-ный раствор серной кислоты

0,01 или 0,02 %-ный раствор мочевины

Ход работы

            Процедура забора материала предельно проста: в стаканчик на 50 мл налить 3 мл дистиллированной воды и в ней тщательно ополоснуть концевые фаланги 3 – 4 пальцев руки. В результате с кожной поверхности смываются различные водорастворимые метаболиты (аминокислоты, аммонийные соли, глюкоза, мочевина и т.п.).

            Полученный смыв с кожи разделить на две части (2 и 1 мл). К 2 мл смыва добавлить 0,1 мл 1 %-ного раствора хлорида железа (III), сразу же появляется желтое окрашивание. Это так называемая реакция Берга, которую дают алифатические гидроксикислоты. В полученном образце это главным образом молочная кислота, точнее ее соли, лактаты, образующиеся в результате анаэробного гликолиза в тканях и выделяющиеся в том числе и через кожные покровы. Для наглядности ставят еще две пробы: одна – с чистой водой (окраски нет), другая – с 0,5 – 1 %-ным раствором молочной кислоты или сегнетовой соли. Во второй пробе при добавлении хлорида железа (III) развивается такое же желтое окрашивание, как в пробе с кожным смывом.

            Ко второй порции смыва (1 мл) можно добавить 1 мл 0,2 %-ного раствора диметилглиоксима в 25 %-ной серной кислоте, пробу перемешать и поставить в кипящую водяную баню на 5 – 10 минут до появления ярко-желтого окрашивания. В присутствии серной кислоты диметилглиоксим довольно быстро разрушается, по-видимому, с образованием диацетила (обладает характерным кисловатым запахом), и через 3 – 4 дня раствор диметилглиоксима становится непригодным.

Более приемлемый вариант постановки цветной реакции на мочевину следующий. К 1 мл смыва с кожи добавить 0,2 мл 1 %-ного спиртового раствора диметилглиоксима и 1 мл 25 %-ной серной кислоты. Пробу перемешать и поставить в кипящую водяную баню на 5 – 10 минут. В данном случае реактивы неограниченно устойчивы.

Для большей наглядности можно поставить контрольную пробу с чистой дистиллированной водой и пробу с 0,01 или 0,02 %-ным раствором мочевины. При нагревании с диметилглиоксимом в контрольной пробе окраски нет, а во второй пробе окраска такая же, как в пробе с кожным экскретом.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КИСЛОТНОСТИ МОЛОКА

            При определении доброкачественности молока прежде всего определяют его кислотность. Кислотные свойства свежего молока обусловливаются белками, гидрофосфатами и гидроцитратами, дающими ионы водорода. При хранении молока кислотность его повышается вследствие образования молочной кислоты из молочного сахара под влиянием ферментов, выделяемых молочнокислыми бактериями, попадающими из воздуха. Образующаяся молочная кислота осаждает белок – казеин.

            Кислотность молока принято выражать в градусах Тернера (Т). Под градусами Тернера понимают число миллилитров 0,1 н раствора щелочи, необходимых для нейтрализации 100 мл молока. Свежее молоко должно иметь кислотность не выше 20 – 21 ºТ. Свертывание казеина происходит при 27 – 30 ºТ. 

Реактивы и оборудование:

Бюретка

Коническая колба на 50 – 100 мл

Пипетка на 10 мл

Штатив металлический с зажимом

Мензурка

Молоко

Дистиллированная вода

0,1 н раствор щелочи

2 %-ный спиртовой раствор фенолфталеина

Ход работы

10 мл молока вносят пипеткой в колбу, добавляют 20 мл дистиллированной воды и 3 – 5 капель фенолфталеина, смесь взбалтывают. Затем отмечают уровень раствора щелочи в бюретке и постепенно (каплями) приливают его к молоку при взбалтывании до появления слабо-розового цвета, не исчезающего в течение 1 – 2 минут. Число мл раствора щелочи, пошедших на нейтрализацию взятого объема молока, умноженное на 100 (расчеты ведут на 100 мл), показывает кислотность молока в градусах Тернера.

Выделение казеина из молока.

В молоке содержится специфический белок казеин, содержащий фосфор. Содержание этого белка в молоке составляет 80 % от общего числа белков. Казеин обладает кислотными свойствами и находится в молоке в виде растворимой кальциевой соли. При подкислении белок выпадает в осадок в виде белых рыхлых хлопьев, которые легко отделяются при фильтровании.

Выделение жира из молока.

К 6 мл цельного молока прибавляют 2 мл 10 %-ного раствора Na2CO3, хорошо перемешивают и взбалтывают с 5 мл эфира. Эфирный слой помещают в чашечку для выпаривания на водяную баню (под тягой). После испарения эфира остается сливочное масло – молочный жир.

Специфичность действия сахаразы дрожжей

Реактивы

1 Пекарские дрожжи.

2 Раствор крахмала 1 %.

3 Раствор сахарозы 1 %.

4 Сульфат меди (1 % водный раствор).

5 Гидроксид натрия (10 % водный раствор).

6 Дистиллированная вода.

7 Весы.

8 Стеклянная воронка.

9 Бумажный фильтр.

Посуда и приборы

1 Пробирки

2 Термометр – 1.

3 Держатель

4 Ступка фарфоровая с пестиком

5 Водяная баня – 1.

6 Секундомер – 1.

Фермент сахараза катализирует гидролитическое расщепление сахарозы с образованием глюкозы и фруктозы. Действие фермента можно обнаружить по появлению свободной глюкозы, дающей положительную качественную реакцию на свободный полуацетальный гидроксил (реакция "серебряного зеркала", с реактивом Фелинга и т.п.). Сахароза не содержит свободного полуацетального гидроксила, поэтому в подобные превращения не вступает.

Ход работы

1. Для получения сахаразы навеску 0,5 г высушенных пекарских дрожжей тщательно растирают вступке для разрушения дрожжевых клеток. Затем в ступку добавляют 5 мл дистиллированной воды и вновь продолжают растирать полученную массу. Через некоторое время полученную суспензию фильтруют через складчатый фильтр. В фильтрате и содержится фермент сахараза.

2. В 2 пробирки помещают по 1 мл раствора сахаразы и приливают: в 1 пробирку – 1 мл 5 % раствора сахарозы; во 2 – 1 мл 5 % раствора крахмала. Пробирки помещают в водяную баню с температурой 36…38 °С и выдерживают при этой температуре 15 мин.

3. Из каждой пробирки отбирают пробы объемом около 0,5 мл; добавляют в пробу по 10 капель 10 % раствора NaOH и по 3 капли 1 % раствора CuSO4. Затем пробы перемешивают и нагревают до кипения. Образование красного или желтого осадка свидетельствует о наличии в пробе глюкозы.

Полученные результаты оформляют в виде таблицы.

Таблица

№

пробы

Фермент

(сахараза), мл

Раствор

сахарозы, мл

Раствор

крахмала, мл

Наличие

свободной

глюкозы

ОБНАРУЖЕНИЕ ЛЕЦИТИНА В ЖЕЛТКЕ КУРИНОГО ЯЙЦА

Лецитины, относящиеся к группе фосфолипидов, не растворяются в воде и ацетоне, но хорошо растворяются в этиловом спирте, эфире и хлороформе. Поэтому они могут быть выделены из раствора добавлением ацетона или воды. Для приготовления раствора лецитина в стакан помещают 0,5 желтка куриного яйца и, помешивая, прибавляют 40 мл горячего этилового спирта. Раствор охлаждают и фильтруют в сухую колбу.

Ход определения

В сухую пробирку вносят 10 капель ацетона и 1–2 капли концентрированного желтка. Выпадает белый осадок. В другую пробирку прибавляют к 20 каплям спиртового раствора

желтка несколько капель дистиллированной воды до образования устойчивой эмульсии.

В третью сухую пробирку вносят 10 капель спиртового раствора желтка и добавляют 2–4 капли насыщенного спиртового раствора CdCl2. Наблюдают выпадение осадка белого цвета. Сделайте заключение о наличии лецитина в желтке куриного яйца.

ГИДРОЛИЗ ЛЕЦИТИНОВ И ОБНАРУЖЕНИЕ ПРОДУКТОВ ГИДРОЛИЗА

      В результате гидролиза лецитин распадается на составные части: жирные кислоты, холин, глицерин и фосфорную кислоту. В растворе устанавливают их наличие.

Ход определения

Обнаружение холина. К 1–2 мл спиртового экстракта желтка добавляют равный объем 10 %-го раствора NaOH и кипятят 5–10 мин. При нагревании ощущается запах селедочного рассола, характерный для триметиламина, образующегося из холина.

Обнаружение жирных кислот. Полученный гидролизат разбавляют небольшим количеством воды и подкисляют 10 %-м раствором HCl. Выпадает осадок свободных жирных кислот, который отфильтровывают, фильтрат нейтрализуют 10 %-м раствором щелочи и упаривают на водяной бане досуха.

Обнаружение глицерина. Часть сухого остатка смешивают с несколькими кристаллами KНSO4 и нагревают. При этом ощущается резкий запах акролеина, образовавшегося из глицерина.

Обнаружение фосфорной кислоты. Другую часть сухого остатка сплавляют в тигле с небольшим количеством KNO3 и Na2CO3. К охлажденному сплаву приливают 2 мл конц. HNO3 и растирают палочкой, раствор сливают в пробирку и нагревают с небольшим избытком молибденовокислого аммония (5–6 мл). При охлаждении образуется желтый кристаллический осадок фосфорномолибденовокислого аммония.

ОБНАРУЖЕНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА

По химической природе холестерин является циклическим ненасыщенным вторичным спиртом. В основе реакции обнаружения холестерина лежит его способность образовывать окрашенные соединения в присутствии серной кислоты и уксусного ангидрида. Этой реакцией пользуются для количественного определения холестерина в крови. У здоровых взрослых людей в сыворотке крови содержится 1,5–2,5 г/л холестерина.  Содержание его увеличивается у людей пожилого возраста, а также при атеросклерозе, заболеваниях печени, нефрозе, при хроническом панкреатите, гипотиреоидите, при сахарном диабете. Уменьшение содержания холестерина в сыворотке крови наблюдается при тяжелых поражениях печени (цирроз в терминальной стадии, некроз), при сердечной недостаточности с застойной печенью, тяжелой уремии, сепсисе, гипертиреоидите.

Реакция Сальковского. Под действием концентрированной серной кислоты происходит дегидратация холестерина с образованием холестерилена – соединения красного цвета. В сухую пробирку вносят 1 мл хлороформного раствора холестерина или растительного масла и осторожно по стенке пробирки добавляют 0,5 мл конц. H2SO4. На границе жидкостей появляется красное кольцо.

Реакция Либермана – Бурхардта. Эта реакция лежит в основе фотоэлектрокалориметрического метода количественного определения общего холестерина сыворотки крови (по Блюру). В сухую пробирку вносят 1 мл 1 %-го раствора холестерина или растительного масла в хлороформе, 5 капель уксусного ангидрида и наслаивают по стенке 2–3 капли конц. H2SO4. Пробирку помещают на 20 мин в темное место. Постепенно появляется сине-зеленое окрашивание.

ОБНАРУЖЕНИЕ ЭТАНОЛА В КЕФИРЕ, МОЛОЧНОЙ СЫВОРОТКЕ

       Лактоза молока при гидролизе образует β-галактозу и β-глюкозу (в отчете запишите схему гидролиза). Глюкоза под влиянием ферментов дрожжей может сбраживаться – окисляться до этилового спирта и оксида углерода (IV): C6H12O6 →2C2H5OH + CO2

      Для открытия этанола кефир и молочную сыворотку фильтруют. В пробирки наливают по 5 капель фильтрата кефира и молочной сыворотки и добавляют по 5 капель 10 %-го раствора гидроксида натрия, а также несколько капель 1 %-го раствора йода в 2 %-м йодиде калия. В присутствии этанола жидкость мутнеет, появляется запах йодоформа:

C2H5OH + 6NaOH + 4I2 →CHI3 + HCOONa + 5NaI + 5H2O

ОБНАРУЖЕНИЕ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ В МОЛОЧНОЙ СЫВОРОТКЕ

      При хранении молока происходит накопление в нем молочной кислоты. Молочная кислота образуется в результате молочнокислого брожения глюкозы, образовавшейся при гидролизе лактозы, присутствующей в молоке: C6H12O6 →2C3H6O3

      Прокисшее молоко фильтруют. С помощью универсального индикатора определяют среду фильтрата. В чистую пробирку приливают 3–5 капли раствора фенола и 2–3 капли раствора хлорида железа (III). К образовавшемуся раствору фенолята железа (III) сине-фиолетового цвета добавляют по каплям полученный фильтрат кислого молока до изменения первоначальной окраски раствора.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИЛАЗЫ КРОВИ  ПО  ВОЛЬГЕМУТУ

          Принцип метода:   Определение активности амилазы в биологических жидкостях (моча, сыворотка крови, слюна) основано на нахождении наименьшего количества фермента, необходимого для полного расщепления добавленного крахмала в стандартных условиях.

            Амилазная активность мочи выражается количеством миллилитров 0,1% раствора крахмала, который расщепляется ферментом, содержащимся в 1 мл неразведенной мочи, при температуре 45⁰С за 15 минут.

            В норме моча человека содержит мало амилазы, происходящей из поджелудочной железы. Активность амилазы (диастазы) мочи обозначается А⁴⁵⁰ (или d⁴⁵⁰). В норме активность амилазы мочи равна 16-64 ед.

Определение активности амилазы в моче и сыворотке крови широко используется в клинической практике с целью диагностики заболеваний поджелудочной железы. При острых панкреатитах амилазная активность мочи и сыворотки крови увеличивается в десятки раз, особенно в первые сутки заболевания, а затем постепенно возвращается к норме. При почечной недостаточности амилаза в моче отсутствует.

В детском возрасте увеличение активности амилазы наблюдается при эпидемическом паротите, что указывает на одновременное поражение поджелудочной железы вирусом паротита.

        Ход работы:  Берут 10 пронумерованных пробирок, приливают в каждую по 1 мл 0,85% раствора хлорида натрия. Затем в первую пробирку добавляют 1 мл исследуемой мочи. Содержимое этой пробирки перемешивают, несколько раз втягивая и выпуская жидкость из пипетки. Набирают в пипетку 1 мл смеси и переносят ее во 2-ю пробирку и т.д. до 10-й пробирки. Из 10-й пробирки отбирают 1 мл смеси и выливают. В каждую пробирку добавляют по 1 мл 0,85% раствора хлорида натрия, по 2 мл  0,1% раствора крахмала и, перемешав, все пробирки помещают в термостат на 15 мин. при 45^оС. После инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой и ставят по порядку в штатив. Прибавляют в каждую пробирку по 2 капли раствора йода и перемешивают. При реакции с йодом жидкость в пробирках окрашивается в желтоватый, розовый и фиолетовый цвет. Отмечают пробирку с наибольшим разведением мочи, при котором произошло полное расщепление крахмала (желтая окраска с йодом). Полученные данные заносят в таблицу.

Расчёт:   Предположим, что полное расщепление крахмала произошло в первых четырёх пробирках. В четвёртой  пробирке разведение мочи  1 : 16. Следовательно:

            ¹/₁₆ мл мочи расщепила 2 мл 0,1% раствора крахмала

            1 мл неразведенной мочи расщепит Х мл 0,1% раствора крахмала

                   2 · 1 · 16

         X  =  -----------  =  32 мл  0,1 % раствора крахмала.

                        1

Следовательно, активность амилазы (диастазы) мочи равна  32 ед.     

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩИХ ЛИПИДОВ В   СЫВОРОТКЕ КРОВИ

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ:Определение количества общих липидов в сыворотке крови дает информацию о состоянии метаболизма липидов в организме. Общие липиды крови включают: триацилглицерины, фосфолипиды, холестерол, липопротеины, свободные жирные кислоты.

 ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ МЕТОДА: При взаимодействии экстракта липидов с раствором серной кислоты образуется стойкая мелкодисперсная эмульсия, оптическую плотность которой измеряют нефелометрически, по степени мутности смеси.

ХОД РАБОТЫ: взять одну центрифужную пробирку

РЕЗУЛЬТАТ:

Содержание общих липидов находят по калибровочному графику.

НОРМА И КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:

Нормальное содержание общих липидов в сывортке крови

4 - 8 г/л.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО ХОЛЕСТЕРОЛА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ  (метод ИЛЬКА)

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ:В организм человека холестерин поступает с пищевыми продуктами (0,3 - 0,5 г) и постоянно синтезируется в печени, почках, надпочечниках, слизистой оболочке тонкого кишечника, артериальной стенке, коже. При нарушении липидного обмена увеличивается содержание холестерола в крови.

ХИМИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ МЕТОДА:Холестерин в присутствии уксусного ангидрида, смеси уксусной и серной кислот образует ряд структур (продуктов), окрашенных в зеленый цвет. Колориметрическое определение окраски позволяет установить содержание холестерола.

ХОД РАБОТЫ: взять чистую сухую пробирку

ОТМЕРИТЬ ОПЫТ ПРОБА
Сыворотка крови		0,1 мл
Рабочий реактив	2,1 мл

Содержимое  осторожно перемешать встряхиванием (10-12 раз)

Инкубация 20 мин., t - 18 °С.

ФЭК, l= 630 нм, кювета 5 мм.

НОРМА И КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:

Содержание общего холестерола в крови взрослых людей - 3,64 - 6,76 ммоль/л. У детей до года 1,81 - 4,53 ммоль/л, до 14 лет - 3,11 - 5,18 ммоль/л.

Активность амилазы слюны

            Слюна – это сложная биологическая жидкость, участвующая в подержании гоместоза полости рта. В полости рта находится не чистый секрет слюнных желез, а так называемая смешенная слюна или ротовая жидкость. Она представляет с собой суммарный секрет всех слюнных желез, включает также микрофлору, содержимое десневых карманов, десневую жидкость, лейкоциты, остатки пищевых продуктов. Можно количественно определить активность фермента амилазы по Вольгемуту.

           Метод основан на определении наименьшего количества амилазы,  полностью расщепляющей добавленный крахмал. Амилазная активность слюны выражает объемом (в мл) 0,1%-ного раствора крахмала, который расщепляет 1мл не разведенной слюны при температуре 38⁰С в течении 30 минут. В норме амилазная активность слюны составляет 160-320 единиц.

           Данный метод не требует специальной аппаратуры, поэтому можно использовать в химическом кабинете сельской школы. Работать надо в перчетках.

Основная часть.

            Слюна является физиологической жидкостью. Слюна содержит белки: амилазу, лизоцим, альбумины, глобумины и муцин. Кислотность или основность среды физиологических жидкостей определяет биологическую активность клеток организма, которая, в свою очередь, определяется «работой» действующих в них ферментов. Каждая из физиологических жидкостей имеет определенное значение рН, и отклонение от нормы может быть причиной тяжелых заболеваний: рН слюны 6,8, возможные отклонения 5,6-7,9.

           Значение ферментов невозможно переоценить. Только в человеческом организме ежесекундно происходит тысячи и тысячи ферментативных химических реакций. Ферменты амилазы, в которой содержится в слюне (его еще называют птиалином) и в соке тонкого кишечника, помогает превращению крахмала в мальтозу.

           Амилаза относится к гидролизам, катализирует реакцию гидролиза.

           Сейчас химикам известно более 2000 ферментов. Все они обладают рядом специфических свойств, отличающих их от неорганических катализаторов. Слюнные железа – крупные парные железа (три пары). В норме за сутки у человека выделяется 1,5-2 литра слюны.

                                                    Химический состав. (белки).

  Лезоцим – обеззараживающее          Муцин, участвующий            Птиамини мальтоза-

                      вещество слюны.            в образовании пищевого       ферменты,

                                                             комка.                                         расщепляющие крахмал до

                                                                                                                  глюкозы.

           В моей работе количественно определяла активность фермента амилазы по Вольгемуту. В 6 пробирок наливаю по 1мл воды, в первую их них добавляю 1мл разведенной в 10 раз слюны. Перемешиваю содержимое этой пробирки и переношу 1мл смеси во вторую пробирку. Содержимое второй пробирки также перемешиваю, переношу и продолжаю так делать до шестой пробирки. Из шестой пробирки выливаю 1мл смеси.

           Во все пробирки добавляю по 1мл  воды и по 2мл 0,1%-ного раствора крахмала, перемешиваю содержимое и встряхиваю пробирки и помещаю их в водяную баню при температуре 38⁰С на 30 минут.  После пробирки охлаждаю холодной водой, а затем добавляю в них по 1 капле 0,1%-ного раствора иода и перемешиваю. Амилаза слюны катализирует реакцию:

                                        (С₆Н₁₀О₅)n+ nH₂O=  декстрины = С₁₂Н₂₂О₁₁.

           При реакции с йодом жидкость в пробирках окрашивается в желтый (мальтоза), оранжевый (ахродекстрины), красный (эритодекстрины), фиолетовый (аминодекстрины) и синий (крахмал) цвета.

           Последней пятой пробирке окраска желтая, это говорит о том, что гидролиз крахмала прошел полностью. В шестой пробирке сахароза (появляется красно-бурый оттенок). В пятой пробирке содержится 1/160 не разведенной слюны.

 Составляю пропорцию:

                                      1/160мл. слюны расщепляет 2мл 0,1%-ного раствора крахмала.

                                      1мл слюны расщепляет Х мл 0,1%-ного раствора крахмала.

Х = 2/1/1/160=320.

           Следовательно, 1мл не разведенной слюны расщепляет за 30мин при температуре 38⁰С 340мл 0,1-ного раствора крахмала.

           Активность амилазы записывается следующим образом:

                                                                                 А(38⁰С 30мин.) = 320 единиц.

Заключение.

           Отсюда делаю вывод: амилазная активность моей слюны составляет 320единиц. Считаю, что амилазная активность моей слюны в норме. У меня зубы не болею, постоянно пользуюсь зубной пастой.  Хочу в дальнейшем исследовать зависимость активности амилазы слюны от вида применения зубной пасты и от вида жевательной резинки.

                                                  Литература:

1. Артюхина А.И амилаза слюны как объект научного исследования.

Химия в школе №8. 2006г.

1. Воскресенский П.И. Неймарк А.М. основы химического анализа.

Москва. Просвещение. 1972г.

1. Осипова Т.А. о пищевых продуктах языком химии.

Химия в школе. №8. 2001г.

           Выбранный объект интересен, а методика его анализа достаточно простая, доступная и в то же время новая.

           Осваивая данную методику, учащиеся вспоминают свойства двух классов органических соединений (углеводы, белки) и интегрируют свои знания из курсов химии и биологии. Познание начинается с удивления. Удивление вызванное новым, ведет к развитию любознательности (чувствительности к проблемам в окружающем мире) с последующим формированием у учащихся устойчивого интереса к предмету.

                                                      Рецензия.

           Научно-исследовательская работа школьников имеет свою специфику: выбранный объект должен быть интересен, а методика его анализа должна простой, доступной и в тоже время новой. Исследуя данный объект учащийся вспоминает свойства двух классов органических соединений (углеводы, белки) и интегрирует свои знания из курсов химии и биологии.

           Исследуя активность, амилаза слюны ученик понимает ее зависимость от вида зубной пасты, от вида жевательной резинки, влияние курения. Поскольку в клинической биохимии идет расширение объектной базы и пристальное внимание обращается на слюну, полученные данные имеют перспективы применения на практике.

                                 рецензировала учитель химии Iкатегории Лыктыпова Н.Ш.