Комплект раздаточного материала
учебно-методический материал

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БУРЯТИЯ

ГАПОУ «БАЙКАЛЬСКИЙ БАЗОВЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ КОЛЛЕДЖ МЗ РБ»

КОМПЛЕКТ РАЗДАТОЧНОГО МАТЕРИАЛА

Для практического занятия

по дисциплине      Основы микробиологии и иммунологии

тема занятия          Физиология бактерий, методы её изучения

Специальность      34.02.01.  Сестринское дело

Курс                        I первый

Селенгинск, 2023 г

Инструкция: выберите один правильный ответ

                                                              ВАРИАНТ № 1.

1. М/о живущие и размножающиеся за счет органических веществ живой клетки, называются:

а) сапрофиты

б) автотрофы

в) паразиты

г) фототрофы.

2. По способности усваивать азот, клубеньковые бактерии и азотобактерии это:

 а) аминоавтотрофы

 б) аминогетеротрофы

 в) автотрофы

 г) гетеротрофы.

 3. М/о, на которые кислород действует губительно, называются:

 а) факультативные анаэробы

 б) строгие аэробы

 в) строгие анаэробы

 г) капнофилы.

 4.  Ферменты, постоянно находящиеся в м/б клетке, независимо от условий среды, называются:

а) конститутивные

б) адаптивные

в) индуктивные

г) защитные.

5. Фермент амилаза, синтезирующийся м/о при посеве их на  питательную среду, которая содержат крахмал, называется:

а) эндофермент

б) экзофермент

в) конститутивный фермент

г) индуктивный фермент.

                                     ВАРИАНТ № 2.

1. По способности усваивать углерод, бактерии гниения относятся к:

а) паразитам

б) сапрофитам

в) автотрофам

г) хемотрофам.

2.По источнику энергии м/о, использующие энергию солнечного света относятся к:

а) хемотрофам

б) фотобактериям

в) фототрофам

г) автотрофам

3. М/о для существования, которых необходим кислород, называются:

а) строгие анаэробы

б) строгие аэробы

в) факультативные анаэробы

г) капнофилы

4.Ферменты, участвующие в реакциях обмена веществ, происходящих  внутри  клетки, называются:

а) эндоферменты

б) экзоферменты

в) протеазы

г) гидролазы.

5. Фермент протеаза постоянно находиться в м/о клетке и относится к:

а) индуктивным

б) адаптивным

в) конститутивным

г) защитным

                                                             ВАРИАНТ № 3.

1. По типу питания вирусы принадлежат к:

а) сапрофитам

б) паразитам

в) автотрофам

г) фототрофам.

2. М/о, способные размножаться при наличии кислорода и при его отсутствии называются:

а) строгие анаэробы

б) строгие аэробы

в) факультативные анаэробы

г) капнофилы.

3. Фермент гидролаза, вызывающий во внешней среде гидролиз белков, жиров и углеводов, относится к:

а) экзоферментам

б) эндоферментам

в) конститутивным

г) адаптивным.

4. Упорядоченное воспроизведение всех клеточных компонентов  и увеличение размеров отдельной особи, называется:

а) размножение

б) деление

в) рост

г) репродукция.

5. М/о, обладающие способностью светиться, называется:

а) хемотрофы

б) хемобактерии

в) фототрофы

г) фотобактерии.

                            ВАРИАНТ № 4.

1. М/о, играющие важную роль в разложении мертвых органических остатков, относятся к:

а) паразитам

б) автотрофам

в) сапрофитам

г) хемотрофам.

2. М/о, получающие энергию за счет окисления неорг. веществ, относятся к:

а) ферментам

б) фототрофам

в) фотобактериям

г) хемотрофам.

3. Вещества белковой природы, биологические катализаторы, которые играют важную роль в обмене веществ, называются:

а) нуклеоид

б) фермент

в) углевод

г) пилин.

4. М/о, для которых необходим кислород, называются:

а) факультативные анаэробы

б) строгие аэробы

в) строгие анаэробы

г) капнофилы.

5. Фермент- протеаза постоянно находиться в м/б клетке и относится к:

а) экзоферментам

б) адаптивным

в) конститутивным

г) индуктивным.

Практическое занятие № 7.  Физиология бактерий, методы её изучения

Питательные среды  и микробиологическое исследование

Для культивирования микроорганизмов (выращивание в искусственных условиях in vitro) необходимы особые субстраты - питательные среды. На средах микроорганизмы осуществляют все жизненные процессы (питаются, дышат, размножаются и т. д.), поэтому их ещё называют средами для культивирования.

Классификация сред

Потребность в питательных веществах и свойствах среды у разных видов микроорганизмов неодинакова. Это исключает возможность создания универсальной среды. Кроме того, на выбор той или иной среды влияют цели исследования.

В настоящее время предложено огромное количество сред, в основу классификации которых положены следующие признаки.

Исходные компоненты

По исходным компонентам различают натуральные и синтетические среды. Натуральные среды готовят из продуктов животного и растительного происхождения. В настоящие время разработаны среды, в которых ценные продукты (мясо и др.) заменены не пищевыми: костной и рыбной мукой, кормовыми дрожжами, сгустками крови и др. Несмотря на то, что состав питательных сред из натуральных продуктов очень сложен и меняется в зависимости от исходного сырья, эти среды нашли широкое применение.

Синтетические - среды готовят из определенных химически чистых органических и неорганических соединений, взятых в точно  указанных концентрациях и растворенных в дважды дистиллированной воде. Важное преимущество этих сред в том, что состав их постоянен, т.е. сколько и какие вещества в них входят.

Консистенция. Степень плотности

Среды бывают: жидкие, плотные, полужидкие. Плотные и полужидкие среды готовят из жидких, к которым добавляют обычный агар-агар или желатин. Агар - полисахарид, получаемый из определенных сортов водорослей. Служит только уплотнителем. В воде агар плавится при 100оС, застывает при (40-45)°С. Желатин - белок животного происхождения. При (25-30)ОС желатиновые среды плавятся, поэтому культуры обычно выращиваются при комнатной температуре. Некоторые микроорганизмы используют желатин как питательное вещество - при их росте среда разжижается. Кроме того, в качестве плотных питательных сред применяют свернутую сыворотку крови, свернутые яйца, картофель, среды с силикагелем.

Состав

Среды делятся на:простые и сложные. К простым средам относится мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), бульон и агар Хоттингера, питательный желатин, пептонная вода. К сложным средам добавляется кровь, сыворотка, углеводы и другие вещества, необходимые для размножения того или иного микроорганизма.

Назначение

Основные (общеупотребительные) среды служат для культивирования большинства патогенных микробов. Это вышеупомянутые МПА, МПБ, бульон и агар Хоттингера, пептонная вода;

Специальные среды служат для выделения и выращивания микроорганизмов, не растущих на простых средах. Например, для культивирования стрептококка к средам прибавляют сахар, для пневмо- и менингококков - сыворотку крови, для возбудителя коклюша - кровь;

Элективные (избирательные) среды служат для выделения определенного вида микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов. Так соли желчных кислот, подавляя рост кишечной палочки, делают среду элективной для возбудителя брюшного тифа. Среды становятся элективными при добавлении к ним определенных антибиотиков, солей, изменении рН.

Жидкие элективные среды называются средами накопления. Примером такой среды служит пептонная вода рН 8,0. При таком рН на ней активно размножается холерный вибрион, а другие микроорганизмы не растут;

Дифференциально-диагностические среды позволяют отличить (дифференцировать) один вид микробов от другого по ферментативной активности, например среды Гисса с углеводами и индикатором, т.е. при росте микроорганизмов, расщепляющих углеводы, изменяется цвет среды;

Консервирующие среды предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала; в них предотвращается отмирание патогенных микроорганизмов и подавляется развитие сапрофитов. Пример такой среды - глицериновая смесь, используемая для сбора испражнений при исследованиях, проводимых с целью обнаружения ряда кишечных бактерий. 

Приготовление сред

Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ, например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла, или оксидов железа, которые могут попасть в среду при варке её в ржавых кастрюлях. Лучше всего пользоваться стеклянной, эмалированной или алюминиевой посудой. Большие количества среды (десятки и сотни литров) готовят в специальных варочных котлах или реакторах. Перед употреблением посуду необходимо тщательно вымыть, прополоскать и высушить. Новую стеклянную посуду предварительно кипятят 30 минут в 1-2% растворе хлороводородной кислоты или погружают в этот раствор на ночь, после чего в течение часа прополаскивают в проточной воде.

Внимание! Посудой предназначенной для приготовления сред, нельзя пользоваться в других целях, например для хранения химических реактивов или дезинфицирующих растворов - даже следы этих веществ могут помешать росту микроорганизмов.

Исходным сырьём для приготовления большинства сред служат продукты животного и растительного происхождения: мясо и его заменители, молоко, яйца, картофель, соя, кукуруза, дрожжи и др.

Основные питательные бульоны готовят воде на мясной или на различных переварах, полученных при кислотном или ферментативном гидролизе исходного сырья. Бульоны из переваров 5-10 раз экономичнее, чем из мясной воды. Среды на переварах богаче аминокислотами, следовательно, питательнее; обладают большей буферностью, т.е. имеют более стабильную величину рН. Кроме того, перевары можно готовить из заменителей мяса (сгустков крови, плаценты, казеина и т. д.)

В настоящее время снабжение лабораторий мясной водой и переварами централизованно. Чаще используются панкреатическим переваром Хоттингера, гидролизатами казеина или кормовых дрожжей. Из этих полуфабрикатов по определённым рецептам готовят необходимые среды 

Этапы приготовления среды: 1) варка; 2) установление оптимальной величины рН; 3) осветление; 4)фильтрация; 5) разлив; 6)стерилизация; 7) контроль.

Варят среды на открытом огне, водяной бане, в автоклаве или варочных котлах, подогреваемых паром.

Установление рН сред ориентировочно производят с помощью индикаторных бумажек. Для точного определения рН пользуются потенциометром, применяя стеклянные электроды в соответствии инструкцией или компаратором (аппарат Михаэлиса), состоящим из штатива с гнёздами для пробирок и набора стандартов определённого рН. При приготовление сред пользуются обычно индикатором метанитрофенолом, изменяющим свой цвет в диапазоне 6.8-8,4.

Для определения рН среды 4 пробирки, диаметр и цвет стекла которой не отличается от пробирок со стандартами, помещают в гнёзда 1, 2, 3 и 5.В 1-ую и 3-ьюпробирки наливают по 5 мл индикатора. В гнёзда 4 и 6 ставят стандарты нужного рН. В 1-ую, 2-ую и 3-ью пробирку наливают 2 мл охлаждённой среды. Содержимое пробирки смешивают.

Цвет жидкостей в пробирках сравнивают в проходящем свете, закрыв заднюю прорезь прибора фильтром (матовым или синим, если жидкости интенсивно жёлтые); рН испытуемого раствора соответствует рН стандарта, с цветом которого совпадает его цвет.

Готовят среды с заданным рН, в гнезде 4 и 6 ставят стандарты, рН которых близок к требуемому, а во 2-ю пробирку с испытуемой средой и индикатором добавляют из бюретки определённое количество щелочи, если жидкость во 2-ой пробирке светлее стандартов, или раствора кислоты - если светлее стандарты. Щелочь (или кислоту) приливают до тех пор, пока цвет жидкости во 2-ой пробирке не совпадёт с цветом стандартов. Количество щелочи (или кислоты), прибавленное к 2 мл среды во 2-ой пробирке, пересчитывают на весь объем приготовленной среды. Например, если для получения нужного рН на 2 мл среды пошло 2 капли (0,1 мл) 0,05 нормального раствора щелочи, то для подщелачивания 1 л нужно в 500 раз больше, т.е. 50мл 0,05 нормального или 2,5 мл 1 нормального раствора щелочи.

При стерилизации рН сред снижается на 0,2, поэтому для получения среды с рН 7,2-7,4 её сначала готовят с рН 7,4-7,6.

Осветление сред производят, если при варке они мутнеют или темнеют. Для осветления в среду, подогретую до 50оС, вливают белок куриного яйца, взбитый с двойным количеством воды, перемешивают и кипятят. Свертываясь, белок увлекает в осадок взвешенные в среде частицы. Таким же способом можно вместо яичного белка использовать сыворотку крови (20-30 мл на 1л среды).

Фильтрация жидких и расплавленных желатиновых сред производят через влажный бумажный или матерчатые фильтры. Фильтрация агаровых сред затруднена - они быстро застывают. Обычно их фильтруют через ватно-марлевый фильтр (в воронку помещают марлевую салфетку и на нее пышный комок ваты). Можно пользоваться бумажным или матерчатым фильтрами, если проводить фильтрацию в горячем автоклаве или воронках с подогревом.

Фильтрацию агаровых сред можно заменить отстаиванием. Среду наливают в высокий цилиндрический сосуд и расплавляют в автоклаве. При медленном остывании среды в выключенном приборе взвешенные в ней частицы оседают на дно. На следующий день агаровый сгусток извлекают из сосуда (для этого сосуд ненадолго помещают в горячую воду) и отрезают ножом нижнюю часть со скопившимся осадком. Верхнюю часть расплавляют и разливают в соответствующие емкости.

Разливают среды в пробирки (по 3-5 мл или по 10 мл), флаконы, колбы, матрицы и бутылки не более, чем 2/3 емкости, так как при стерилизации могут намокнуть пробки и среды утратят стерильность.

Среды, которые стерилизуют при температуре выше 100оС, разливают в чистую сухую посуду. Среды, стерилизуемые при более низкой температуре, обязательно разливают в стерильную посуду.

Разливают с помощью воронки, на конец которой надета резиновая трубка с зажимом Мора. Для мерного разлива применяют мензурки, бюретки, дозаторы, шприцы-пипетки.

Посуда со средой обычно закрывается ватно-марлевыми пробками, поверх которых надевают бумажные колпачки. Важно, чтобы при разливе среда не смачивала края посуды, иначе к ним могут прилипнуть пробки. К каждому сосуду обязательно прикрепляют этикетку с названием среды и датой приготовления.

Стерилизация. Режим стерилизации зависит от состава среды и указан в рецепте.

Примерная схема стерилизации

К средам прибавляют сахар, для пневмо- и менингококков - сыворотку крови, для возбудителя коклюша - кровь;

Элективные (избирательные) среды служат для выделения определенного вида микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов. Так соли желчных кислот, подавляя рост кишечной палочки, делают среду элективной для возбудителя брюшного тифа. Среды становятся элективными при добавлении к ним определенных антибиотиков, солей, изменении рН.

Жидкие элективные среды называются средами накопления. Примером такой среды служит пептонная вода рН 8,0. При таком рН на ней активно размножается холерный вибрион, а другие микроорганизмы не растут;

Дифференциально-диагностические среды позволяют отличить (дифференцировать) один вид микробов от другого по ферментативной активности, например среды Гисса с углеводами и индикатором. При росте микроорганизмов, расщепляющих углеводы. Изменяется цвет среды;

Консервирующие среды предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала; в них предотвращается отмирание патогенных микроорганизмов и подавляется развитие сапрофитов. Пример такой среды - глицериновая смесь, используемая для сбора испражнений при исследованиях, проводимых с целью обнаружения ряда кишечных бактерий.

Контроль

Готовые среды подлежат контролю.

1. Контроль стерильности: среды ставятся в термостат на 2 суток, после чего просматривают. Если нет признаков роста, их считают стерильными.
2. Химический контроль: окончательно устанавливают рН, содержание общего и аминного азота, пептона, хлоридов (их количество должно указываться в рецепте). Химический контроль производится в химической лаборатории.
3. Биологический контроль. Несколько образцов среды засевают специально подобранными культурами микроорганизмов, и по их росту судят о питательных свойствах среды. К готовой среде прилагают этикетку и паспорт, в котором указывают название и состав среды, результат контроля и др.

Хранение

Среды хранятся при комнатной температуре в шкафах, желательно специально для них предназначенных. Не которые среды, например среды с кровью и витаминами, хранят в холодильнике.

Сухие среды

Промышленность выпускает сухие среды разного назначения: простые, элективные, дифференциально-диагностические, специальные. Это порошки во флаконах или пакетах. Хранят сухие среды в темном месте плотно закрытыми - они гигроскопичны. В лаборатории из порошков готовят среды по прописи на этикетке.

Преимущество сухих сред: стандартность, простота приготовления, стабильность, экономичность. Их можно готовить из заменителей: гидролизата казеина, фибрина, кильки и даже белковых фракций микробных клеток.

Приготовление основных питательных сред

Мясопептонный бульон (МПБ). К мясной воде прибавляют 1% пептон и 0,5% х.ч. натрия хлорида, кипятят на слабом огне 10-15 мин для растворения веществ, устанавливают нужный рН и снова кипятят 30-40мин до выпадения осадка. Фильтруют, доливают до первоначального объема водой и стерилизуют 20мин при 120°С.

Мясопептонный агар (МПА). К готовому бульону добавляют 2-3% измельченный агар-агар и кипятят, помешивая на слабом огне до полного расплавления агара, или автоклавируют. Готовую среду осветляют, фильтруют и стерилизуют 20 мин при 120°С.

Желточно-солевой агар Чистовича. Готовят желточную смесь (1 желток куриного яйца на 150 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида). К мясопептонному солевому агару (8-10% натрия хлорида), растопленному и остуженному до 45°С, добавляют 20% желточной взвеси (соблюдают стерильность) и разливают в чашки. Среда для работы со стафилококком.

Требования, предъявляемые к средам

1. Среды должны быть питательными, т.е. содержать вещества, необходимые для жизнедеятельности клетки. В состав сред входят органогены (азот, углерод, кислород, водород); соли (натрия, калия и т.д.); микролэлементы (железо, медь, хром, цинк и т.д.) и факторы роста (витамины, гормоны и т.д.), быть в усвояемом для микроба виде.
2. Среды должны иметь определенную концентрацию водородных ионов, для изменения которой служит водородный показатель - рН. Для большинства патогенных микробов оптимальным (т.е. обеспечивающим наилучшие условия) является слабощелочной рН (7,2-7,4). Исключение составляют холерный вибрион; для него оптимум находится в щелочной зоне (рН 8,0-8,6), и туберкулезная палочка, нуждающаяся в слабокислом рН (6,2-6,8). Чтобы во время роста микробов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не изменили рН, среды должны обладать буферностью, т.е. содержать вещества, способные нейтрализовать продукты обмена.

3. Среды должны быть изотоничными для микробной клетки, т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки, т.е. 0,5% раствора NaCl..
4. Среды должны быть стерильными, т.к. посторонние микроорганизмы препятствуют росту микроба, определению его свойств и изменяют свойства среды (состав, рН и др.).
5. Среды должны быть влажными и не слишком вязкими, т.к. питание микробов осуществляется за счет осмоса и диффузии.
6. Среды должны обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, т.е. соотношением веществ отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом гН2, показывающий насыщение среды кислородом. Для одних микробов нужен высокий потенциал, для других - низкий. Например, анаэробы размножаются при гН2 не выше 5, а аэробы - при гН2 не ниже 10.
7. Среды должны содержать постоянные количества отдельных ингредиентов. Так, в средах для культивирования большинства патогенных бактерий должно быть 0,8-1,2 г/л аминного азота (NH2), т.е. суммарного азота аминогрупп аминокислот и низших полипептидов; 2,5-3.0 г/л общего азота (N); 0,5% хлоридов в пересчете на NaCl; 1% пептона. Желательно, чтобы среды были прозрачными: удобнее следить за ростом культур; легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами.

Методы выделения чистых культур 

(аэробов и факультативных анаэробов).

Выделение чистых культур бактерий - обязательный этап бактериологического исследования в лабораторной диагностике инфекционных болезней, при изучении различных объектов окружающей среды. Исследуемый материал (гной мокрота, фекалии, вода, почва и др.) обычно содержат ассоциации микробов. Для выделения отдельных культур используют методы, которые условно можно разделить на 2 группы:

1. Методы, основанные на принципе механического разобщения
микроорганизмов в питательной среде;

• метод Пастера - последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде;
• метод Коха - последовательное разведение исследуемого материала в пробирках с расплавленным агаром, далее содержимое каждой пробирки выливают в стерильную чашку Петри, где агар застывает; после инкубации на поверхности агара в чашке и внутри питательной среды вырастают изолированные колонии;
• метод Дригальского - рассев материала на поверхность питательной агара чашки Петри с помощью шпателя, петли или тампона с последовательным переносом во вторую и третью чашки Петри.

2. Методы, основанные на использовании биологических особенностей микроорганизмов:

- применение элективных (избирательных) питательных сред;

- создание условий культивирования (соответствующие среды, температура, концентрация СО2, О2 и т.п.)

- биологический метод - заражение животных, восприимчивых к данному виду микробов, с последующим выделением культуры из их органов и крови при заболевании или гибели.

Этапы выделения чистой культуры по Дригальскому

и ее изучение с целью идентификации.

1-ый этап. Рассев исследуемого материала по поверхности плотной питательной среды для получения изолированных колоний. Инкубация в термостате (обычно в течении суток)

2-ой этап. Изучение выросших на среде колоний (макро- и микроскопическое). Отсев колонии, характерной для определенного вида, на скошенный агар для получения чистой культуры.

3-ий этап. Идентификация, т.е. определение вида выделенной чистой культуры на основании изучения биологических свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных (характер роста на различных жидких и плотных питательных средах), биохимических (ферментативных), вирулентных, токсигенных, антигенных, чувствительности к диагностическим фагам, к антибиотикам и другим веществам.

Первый день исследования. Изучаемый материал микроскопируют и высевают на плотную среду в чашки Петри шпателем или бактериальной петлей (в отдельных случаях - в жидкую среду обогащения). Посевы помещают в термостат на 18-24 ч при температуре 37 °С.

Второй день исследования. На извлеченных из термостата чашках Петри с посевами изучают специфические признаки выросших на поверхности питательной среды колоний.

1. Вначале рассматривают их невооруженным глазом со стороны дна чашки Петри в проходящем свете, если имеются два различных вида колоний, их нумеруют и описывают каждую в отдельности.

В протоколе отмечают следующие данные:

а) размеры колоний (крупная - 4-5 мм в диаметре и более, средняя - 2-4 мм, мелкая -1-2 мм, карликовая - менее 1мм);

б) форму очертаний (правильно или неправильно округлая, розеткообразная, розоидная и др.);

в) степень прозрачности (непрозрачная, полупрозрачная, прозрачная).

2.        Далее колонии описывают в отраженном свете со стороны крышки, отмечая:

а) цвет (бесцветная, пигментированная);

б) поверхность (гладкая, блестящая, влажная или морщинистая, матовая, сухая);

в) положение на питательной среде (возвышающаяся  над средой, погруженная или сливающаяся с ней, плотно прилегающая к среде, уплощенная).

3.        Приступают к микроскопическому изучению структуры колоний. Чашку Петри устанавливают вверх дном на предметном столике микроскопа, опускают конденсор и объективом х8 изучают:

а) характер краев  (ровные, волнистые, зазубренные, бахромчатые);

б) структуру (гомогенная или аморфная, зернистая, волокнистая).

Из колонии готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Остаток колонии пересевают на скошенный агар для получения чистой культуры в достаточном количестве. Пробирки с посевами помещают в термостат на 18 —24 ч при температуре 37 оС.

Посев инокулянта

Посев инокулята является первым этапом исследования. В практической работе для получения «чистых культур» микроорганизмов используют одну из модификаций методов посева на чашки со средой.

1. Посев петлей: посевной материал втирают петлей в поверхность среды у края чашки, избыток снимают, проколов петлей агар, а оставшийся материал рассеивают параллельными штрихами по стерильной поверхности среды.
2. Посев шпателем: материал наносят на поверхность среды петлей или пипеткой, а затем стеклянным или металлическим шпателем тщательно втирают его по всей поверхности агара. При этом левой рукой придерживают слегка приоткрытую крышку и одновременно вращают чашку. После посева металлический шпатель прокаливают в пламени горелки, а стеклянный помещают в дезинфицирующий раствор.
3. Посев тампоном: тампон с исследуемым материалом вносят в чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в поверхность среды, одновременно вращая тампон и чашку.

4. Посев на секторы: дно чашки расчерчивают на секторы, посев производят зигзагообразными движениями от края чашки к центру так, чтобы штрихи с одного не заходили на другой.
5. Посев газоном: 1мл исследуемого материала (жидкая бульонная культура или взвесь микробов в физиологическом растворе) наносят пипеткой на поверхность среды и тщательно распределяют жидкость по всей поверхности. Избыток материала отсасывают пипеткой и вместе с ней помещают в дезинфицирующий раствор. После посева чашки закрывают и переворачивают вверх дном. Надписи на чашках делают со стороны дна, а на пробирках в верхней части.

При посеве инокулята из пробирки в пробирку обе пробирки с посевным материалом и средой) держат слегка наклонно в левой руке между большим и указательным пальцем так, чтобы края пробирок были на одном уровне. Бактериальную петлю держат как писчее перо. Петлю вертикально прокаливают в пламени спиртовки. Пробки из пробирок вынимают правой рукой, зажимая их между мизинцем и ладонью. Вынув пробки, края пробирок обжигают в пламени горелок. Прокаленную петлю вводят через пламя горелки в пробирку с посевным материалом, охлаждают, и небольшое количество посевного материала осторожно переносят в пробирку со средой.

При посеве на жидкую среду петлю слегка погружают в жидкость и растирают посевной материал на стекле пробирки, после чего смывают средой. Для посева жидкого материала можно использовать стерильные пипетки (пастеровские или градуированные).

При посеве на скошенный агар материал наносят штрихообразными движениями снизу вверх, начиная с конденсационной воды, а если агар или желатин разлит в пробирки столбиком, то посев производят уколом, прокалывая петлей с посевным материалом столбик до дна.

После посева петлю извлекают из пробирки, пробирку закрывают, предварительно проведя ее края через пламя горелки. Петлю прокаливают.

При выделении чистых культур аэробов можно использовать не только методы, основанные на механическом разобщении бактерий, но и методы, основанные на различиях бактерий по биологическим свойствам. Так, например, некоторые подвижные бактерии могут быстро распространяться по слегка влажной поверхности питательной среды, благодаря этому можно очистить их от неподвижных видов микробов.

Иногда при выделении микроорганизмов из природных популяций полезно включить в среду вещества, избирательно подавляющие рост тех или иных микробов. Например, добавление полиеновых антибиотиков (нистатина) в среду используется для очистки бактериальных культур, сильно загрязненных грибами. Посевы инкубируют в термостате 18 -24 часа. В течение этого времени из отдельных микробных клеток формируется изолированные колонии.

Колония - это популяция микробных клеток одного вида, сформировавшаяся в результате деления одной микробной клетки в условиях культивирования на плотной питательной среде при оптимальной температуре.

Этико-деонтологическое  обеспечение при лабораторных исследованиях

ЗАПОМНИТЕ!

От правильного сбора крови, мокроты, мочи, кала для исследования и своевременности доставки биологического материала в лабораторию во многом зависит достоверность лабораторных данных, а значит правильность диагностики и эффективность лечения.

При инструктировании

1. Посев тампоном

Цель Оградить посев исследуемого материала от посторонних микроорганизмов.

Показания

• выращивание микроорганизмов;
• выделение чистой культуры;
• идентификация чистой культуры (установление принадлежности к определенному роду, виду, подвиду).

Оснащение

• штатив;
• тампон в пробирке с исследуемым материалом;
• стерильная питательная среда;
• стеклограф;
• перчатки;
• ватные шарики;
• спирт этиловый  70%-ый  раствор;
• перекись водорода 3 %-ый раствор.

Техника посева тампоном

Внимание! Не забывайте выполнять правила личной безопасности при работе с заразным материалом.

1. Надевают  маску, перчатки.
2. В левую руку берут чашку Петри со стерильной питательной средой.
3. В правую руку берут тампон большим и указательным пальцами.
4. Тампоном делают «площадку» на посевной поверхности. Материал втирают в среду со всей поверхности тампона круговыми движениями. Вначале у края чашки, не повреждая поверхности среды, затем наносят, отрывая  друг от друга, параллельные штрихи на расстоянии 0,5 см друг от друга; 
5. По окончании посева чашку закрывают.
6. Тампон возвращают в пробирку.
7. Чашку переворачивают вверх дном, подписывают, ставят в термостат.
8. Обрабатывают рабочее место по окончании работы 3 %-ым  раствором  перекиси водорода или 70 %-ым раствором спирта.
9. Обрабатывают перчатки 3 %-ым  раствором  перекиси водорода или 70 %-ым раствором спирта.
10. Обрабатывают руки 70 %-ым раствором спирта.

2. Посев ректальной петлей

Цель

Оградить посев исследуемого материала от посторонних  микроорганизмов.

Показания

• выращивание микроорганизмов;
• выделение чистой культуры;
• идентификация  чистой культуры (установление  принадлежности к определенному роду, виду, подвиду).

Оснащение

• штатив;
• ректальная петля с исследуемым материалом;
• чашки Петри со средами Эндо, Левина, Плоскерева, висмут-сульфитная  среда, среда обогащения;
• стеклограф;
• перчатки;
• ватные шарики;
• спирт этиловый  70%-ый раствор;
• перекись водорода 3%-ый раствор.

 Техника посева  ректальной петлей

Внимание!

1. Не забывайте выполнять правила личной  безопасности при работе с заразным материалом.
2. Надевают  маску, перчатки.
3. В левую руку берут чашку Петри со стерильной питательной средой.
4. В правую руку  берут тампон  большим и указательным пальцами.
5. Ректальной петлей делают площадку на посевной поверхности среды. Исследуемый материал втирают в поверхность питательной среды вначале у края чашки, не повреждая поверхности среды, затем наносят, отрывая друг от друга, параллельные штрихи на расстоянии 0,5 см друг от друга.
6. Посевы производят в три чашки Петри  с питательными средами, возвращая ректальную петлю после каждого посева в пробирку с консервирующей питательной средой.
7. По окончании посева  чашку закрывают.
8. Ректальную петлю возвращают в пробирку.
9. Чашку переворачивают кверху дном, подписывают, ставят в термостат.
10. По окончании работы обрабатывают рабочее место 3%-ым раствором  перекиси водорода или 70 %-ым раствором спирта.
11. Обрабатывают перчатки 3%-ым  раствором перекиси водорода или 70 %-ым раствором спирта.
12. Обрабатывают руки 70 %-ым раствором спирта.

3. Посев шпателем

Цель Оградить посев исследуемого материала от посторонних  микроорганизмов.

Показания

• выращивание микроорганизмов;
• выделение чистой культуры;
• идентификация  чистой культуры (установление  принадлежности к определенному роду, виду, подвиду).

Оснащение

• спиртовка;
• спички;
• завернутый в бумагу стерильный шпатель (стеклянный или металлический);
• завернутая в бумагу стерильная пипетка;
• пробирка с жидкой культурой;
• штатив;
• чашка  Петри с питательной средой;
• емкость с дезинфицирующим   раствором (перекись водорода 5%-ый раствор)
• спирт этиловый  70%-ый раствор;
• перекись водорода 3%-ый раствор.

 Техника посева шпателем

Внимание!

Не  забывайте выполнять правила личной  безопасности при работе с заразным материалом.

1. Надевают маску, перчатки.
2. Зажигают спиртовку.
3. Освобождают от бумаги  пипетку, шпатель.
4. В левую руку берут  пробирку с культурой.
5. В правую  руку стерильную пипетку (заранее  освободив от бумаги и надев грушу).
6. В пипетку отсасывают каплю жидкости.
7. Пробирку закрывают и ставят  в штатив.
8. В левую руку берут  чашку с питательной средой.
9. Наносят  из пипетки  в центр чашки со средой каплю исследуемой жидкости.
10. Пипетку кладут  в дезинфицирующий раствор.
11. В правую руку берут шпатель  (заранее освободив от бумаги).
12. Шпателем  распределяют  культуру на небольшом участке, а затем круговыми движениями по всей поверхности до тех пор, пока шпатель не перестанет скользить по поверхности среды.
13. По окончании посева чашку закрывают.
14. Шпатель помещают в дезинфицирующий  раствор.
15. Чашку переворачивают кверху  дном, подписывают, ставят в термостат.
16. Гасят спиртовку.
17. Обрабатывают рабочее место  3%-ым раствором перекиси водорода или 70 %-ым раствором спирта.
18. Обрабатывают перчатки 3%-ым раствором перекиси водорода или 70 %-ым раствором спирта.
19. Обрабатывают руки 70 %-ым раствором спирта.

4.  Посев бактериальной петлей  из пробирки в пробирку

Цель

Оградить посев исследуемого материала от посторонних микроорганизмов.

Показания

• выращивание микроорганизмов;
• выделение чистой культуры;
• идентификация  чистой культуры (установление  принадлежности к определенному роду, виду, подвиду)

Оснащение

• штатив с двумя пробирками:

        пробирка с чистой культурой;

        пробирка со стерильной плотной питательной средой  агар;

• спиртовка;
• спички;
• бактериальная петля;
• стеклограф.
• спирт этиловый  70%-ый раствор;
• перекись водорода 3%-ый раствор.

Техника посева петлей

Внимание!

Не  забывайте выполнять правила личной  безопасности при работе с заразным материалом.

1. Надевают маску, перчатки.
2. Пробирку с чистой культурой и пробирку со стерильной средой берут в левую руку так, чтобы пробирка с культурой была первой по отношению к работающему и  края их находились на одном уровне. Основание пробирок поверх кисти. В правую руку, как писчее перо, берут петлю и в вертикальном положении прокаливают в пламени спиртовки.
3. Пробки из пробирок  вынимают одновременно мизинцем и безымянным пальцем  правой руки и зажимают их  между мизинцем и ладонью и держат во время посева.
4. Вынув пробки, края пробок обжигают в пламени спиртовки.
5. Прокаленную петлю  вводят через пламя в пробирку с культурой. Охлаждают и прикасаются к поверхности культуры, набрав немного материала.
6. Петлю с культурой осторожно переносят в пробирку со средой. Опускают, не доходя до границы конденсационной воды, и зигзагообразными движениями распределяют материал по скошенной поверхности.
7. Петлю извлекают:

• обжигают края пробирок;
• вставляют в них одновременно пробки, проведенные через пламя;
• стерилизуют петлю.

8. Пробирку с посевом подписывают и ставят в термостат.
9. Пробирку с чистой культурой ставят  в штатив.
10. Обрабатывают  рабочее место  по окончании работы 3 %-ым  раствором  перекиси водорода или 70 %-ым раствором спирта.
11. Обрабатывают перчатки  3 %-ым  раствором  перекиси водорода или 70 %-ым раствором спирта.
12. Обрабатывают руки  70 %-ым раствором спирта.

5. Посев  бактериальной петлей на секторы (штрихом)

из пробирки в чашку Петри

Чашку со стороны дна разделить на четыре сектора (1,2,3,4).

Цель

Оградить посев исследуемого материала от посторонних микроорганизмов.

Показания

• выращивание микроорганизмов;
• выделение чистой культуры;
• идентификация чистой культуры (установление принадлежности к определенному роду, виду, подвиду).

Оснащение

• штатив;
• пробирки с посевным материалом;
• спиртовка, спички;
• бактериальная петля;
• стеклограф;
• чашки Петри с плотной питательной средой.
• спирт этиловый 70%-ый раствор;
• перекись водорода 3%-ый раствор.

8. Техника посева  петлей

Внимание!

Не забывайте выполнять правила личной безопасности при работе с заразным материалом.

1. Надевают маску, перчатки.
2. Пробирку с посевным материалом берут в левую руку.
3. В  правую руку (как писчее перо) берут бактериальную петлю и в вертикальном положении прокаливают в пламени спиртовки.
4. Из пробирки вынимают мизинцем и безымянным пальцем правой руки пробку, зажимают ее и держат во время посева.
5. Вынув пробку, края пробирки обжигают в пламени спиртовки.
6. Прокаленную петлю вводят через пламя в пробирку с посевным материалом. Петлю охлаждают о стенки пробирки и набирают материал.
7. Осторожно закрывают пробирку пробкой,  проведенную через пламя.
8. Пробирку помещают в штатив.
9. В левую руку берут чашку Петри с питательной средой, приоткрывают крышку.
10. Посев петлей производят штрихом последовательно на сектора 1,2,3,4 от края к центру в каждом секторе, делая штрихи все реже и реже.
11. Необходимо следить, чтобы штрихи не заходили на соседний сектор.
12. По окончании посева чашку закрывают.
13. Прожигают петлю в пламени  спиртовки, ставят в штатив.
14. Чашки переворачивают кверху дном, подписывают, ставят в термостат.
15. Обрабатывают  рабочее место  по окончании работы 3 %-ым раствором  перекиси водорода или 70 %-ым раствором спирта.
16. Обрабатывают перчатки 3%-ым раствором перекиси водорода или 70 %-ым раствором спирта.
17. Обрабатывают руки  70 %-ым раствором спирта.

6.  Посев бактериальной петлей из пробирки в чашку  Петри с  плотной питательной средой.

Цель Оградить посев исследуемого материала от посторонних  микроорганизмов.

Показания

• выращивание микроорганизмов;
• выделение чистой культуры;
• идентификация чистой культуры (установление принадлежности к определенному роду, виду, подвиду).

Оснащение

• штатив;
• пробирки с посевным материалом;
• спиртовка, спички;
• бактериальная петля;
• стеклограф;
• чашки Петри с плотной питательной средой.
• спирт этиловый 70%-ый раствор;
• перекись водорода 3%-ый раствор.

Техника посева  петлей

Внимание!

Не забывайте выполнять правила личной безопасности при работе с заразным материалом.

1. Надевают маску, перчатки.
2. Пробирку с посевным материалом берут в левую руку.
3. В правую руку (как писчее перо) берут бактериальную петлю и в вертикальном положении прокаливают в пламени спиртовки.
4. Из пробирки вынимают мизинцем и безымянным пальцем правой руки пробку, зажимают ее и держат во время посева.
5. Вынув пробку, края пробирки обжигают в пламени спиртовки.
6. Прокаленную петлю вводят через пламя  в пробирку с посевным материалом. Петлю охлаждают о стенки пробирки и набирают материал.
7. Осторожно закрывают пробирку пробкой, проведенную через пламя.
8. Пробирку помещают в штатив.
9. В левую руку берут чашку Петри с питательной средой, приоткрывают крышку.
10. Петлю с посевным материалом осторожно втирают в поверхность среды у края чашки, несколько раз проводя петлей из стороны в сторону, создавая посевную площадку.
11. Затем у того места, где закончились штрихи, агар  прокалывают петлей, снимая избыток посевного материала.
12. Оставшийся на петле посевной материал зигзагообразными движениями распределяют по всей поверхности среды.
13. По окончании посева чашку Петри закрывают.
14. Прожигают петлю в пламени спиртовки, ставят в штатив;
15. Чашку переворачивают кверху дном, подписывают, ставят в термостат.
16. Обрабатывают рабочее место по окончании работы 3 %-ым  раствором  перекиси водорода или 70 %-ым раствором спирта.
17. Обрабатывают перчатки 3 %-ым раствором перекиси водорода или 70 %-ым раствором спирта.
18. Обрабатывают руки  70 %-ым раствором спирта.

7. Посев бактериальной петлей с чашки на чашку Петри с  плотной питательной средой.

Цель Оградить посев исследуемого материала от посторонних  микроорганизмов.

Показания

• выращивание микроорганизмов;
• выделение чистой культуры;
• идентификация чистой культуры (установление принадлежности к определенному роду, виду, подвиду).

Оснащение

• штатив;
• чашка Петри с посевным материалом;
• спиртовка, спички;
• бактериальная петля;
• стеклограф;
• чашки  Петри с плотной питательной средой.
• спирт этиловый  70%-ый раствор;
• перекись водорода 3%-ый раствор.

Техника посева петлей

Внимание!

Не забывайте выполнять правила личной безопасности при работе с заразным материалом.

1. Надевают маску, перчатки.
2. Чашку с культурой берут в левую руку.
3. В  правую руку (как писчее перо) берут бактериальную петлю и в вертикальном положении прокаливают в пламени спиртовки.
4. Приоткрывают крышку чашки с культурой большим пальцем левой руки.
5. Прокаленную петлю вводят через пламя в чашку с культурой. Петлю охлаждают о стенки чашки и набирают материал.
6. Осторожно закрывают чашку, ставят на стол.
7. В левую руку берут чашку Петри с питательной средой, приоткрывают крышку. 
8. Посев петлей производят штрихом последовательно на сектора 1,2,3,4 от края к центру в каждом секторе, делая штрихи все реже и реже.Необходимо следить, чтобы штрихи не заходили на соседний сектор.
9. Затем у того места, где закончились штрихи, агар прокалывают петлей, снимая избыток посевного материала.
10. По окончании посева чашку Петри закрывают.
11. Прожигают петлю в пламени спиртовки, ставят в штатив;
12. Чашку переворачивают кверху дном, подписывают, ставят в термостат.
13. Обрабатывают рабочее место  по окончании работы 3 % - ым  раствором  перекиси водорода или 70 % - ым раствором спирта.
14. Обрабатывают перчатки 3 %-ым раствором перекиси водорода или 70 %- ым раствором спирта.
15. Обрабатывают руки 70 %- ым раствором спирта.

Контроль

Готовые среды подлежат контролю.

4. Контроль стерильности: среды ставятся в термостат на 2 суток, после чего просматривают. Если нет признаков роста, их считают стерильными.
5. Химический контроль: окончательно устанавливают рН, содержание общего и аминного азота, пептона, хлоридов (их количество должно указываться в рецепте). Химический контроль производится в химической лаборатории.

Биологический контроль. Несколько образцов среды засевают специально подобранными культурами микроорганизмов, и по их росту судят о питательных свойствах среды. К готовой среде прилагаютэтикетку и паспорт, в котором указывают название и состав среды, результат

Среды хранятся при комнатной температуре в шкафах, желательно специально для них предназначенных. Не которые среды, например среды с кровью и витаминами, хранят в холодильнике.

Сухие среды

Промышленность выпускает сухие среды разного назначения: простые, элективные, дифференциально-диагностические, специальные. Это порошки во флаконах или пакетах. Хранят сухие среды в темном месте плотно закрытыми - они гигроскопичны. В лаборатории из порошков готовят среды по прописи на этикетке.

Преимущество сухих сред: стандартность, простота приготовления, стабильность, экономичность. Их можно готовить из заменителей: гидролизата казеина, фибрина, кильки и даже белковых фракций микробных клеток.

Приготовление основных питательных сред

Мясопептонный бульон (МПБ). К мясной воде прибавляют 1% пептон и 0,5% х.ч. натрия хлорида, кипятят на слабом огне 10-15 мин для растворения веществ, устанавливают нужный рН и снова кипятят 30-40мин до выпадения осадка. Фильтруют, доливают до первоначального объема водой и стерилизуют 20мин при 120°С.

Мясопептонный агар (МПА). К готовому бульону добавляют 2-3% измельченный агар-агар и кипятят, помешивая на слабом огне до полного расплавления агара, или автоклавируют. Готовую среду осветляют, фильтруют и стерилизуют 20 мин при 120°С.

Желточно-солевой агар Чистовича. Готовят желточную смесь (1 желток куриного яйца на 150 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида). К мясопептонному солевому агару (8-10% натрия хлорида), растопленному и остуженному до 45°С, добавляют 20% желточной взвеси (соблюдают стерильность) и разливают в чашки. Среда для работы со стафилококком.

Требования, предъявляемые к средам

3. Среды должны быть питательными, т.е. содержать вещества, необходимые для жизнедеятельности клетки. В состав сред входят органогены (азот, углерод, кислород, водород); соли (натрия, калия и т.д.); микролэлементы (железо, медь, хром, цинк и т.д.) и факторы роста (витамины, гормоны и т.д.), быть в усвояемом для микроба виде.
4. Среды должны иметь определенную концентрацию водородных ионов, для изменения которой служит водородный показатель - рН. Для большинства патогенных микробов оптимальным (т.е. обеспечивающим наилучшие условия) является слабощелочной рН (7,2-7,4). Исключение составляют холерный вибрион; для него оптимум находится в щелочной зоне (рН 8,0-8,6), и туберкулезная палочка, нуждающаяся в слабокислом рН (6,2-6,8). Чтобы во время роста микробов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не изменили рН, среды должны обладать буферностью, т.е. содержать вещества, способные нейтрализовать продукты обмена.

8. Среды должны быть изотоничными для микробной клетки, т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки, т.е. 0,5% раствора NaCl..
9. Среды должны быть стерильными, т.к. посторонние микроорганизмы препятствуют росту микроба, определению его свойств и изменяют свойства среды (состав, рН и др.).
10. Среды должны быть влажными и не слишком вязкими, т.к. питание микробов осуществляется за счет осмоса и диффузии.
11. Среды должны обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, т.е. соотношением веществ отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом гН2, показывающий насыщение среды кислородом. Для одних микробов нужен высокий потенциал, для других - низкий. Например, анаэробы размножаются при гН2 не выше 5, а аэробы - при гН2 не ниже 10.
12. Среды должны содержать постоянные количества отдельных ингредиентов. Так, в средах для культивирования большинства патогенных бактерий должно быть 0,8-1,2 г/л аминного азота (NH2), т.е. суммарного азота аминогрупп аминокислот и низших полипептидов; 2,5-3.0 г/л общего азота (N); 0,5% хлоридов в пересчете на NaCl; 1% пептона. Желательно, чтобы среды были прозрачными: удобнее следить за ростом культур; легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами.

Приложение 4

Контрольные вопросы по теме занятия

1. Основные требования, предъявляемые к питательным средам, их подразделение по консистенции, составу, назначению. Простые питательные среды. Приготовление, применение.
2. Сложные питательные среды, с повышенной питательной ценностью, примеры, применение.
3. Дифференциально-диагностические среды, принцип приготовления, применение.
4. Элективные питательные среды, сущность действия, примеры, применение.
5. Методы выделения чистых культур бактерий (аэробов, факультативных анаэробов), их подразделение. Метод Коха.
6. Метод выделения чистых культур по Дригальскому, основные этапы. Методика изучения колоний.

Приложение 5

Домашнее задание:

1. Выучить алгоритмы
2. Приготовиться к устному опросу по лекции, и практическому занятию №5.